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在营养匮乏的条件下，细胞通过依赖溶酶体的自噬过程消化细胞内的大分子、错误折叠的蛋白分子、衰老的细胞器等来满足细胞对营养物质的基础需求，得以存活。在胁迫状态下，肿瘤细胞的自噬可以为肿瘤细胞提供营养物质，也可以促进肿瘤细胞脱离基质得以存活。然而，过度的或者是过低的自噬水平会导致细胞死亡。前期的研究表明，信号衔接蛋白p66Shc在细胞的代谢过程中发挥着重要作用;动物体内实验也证实p66Shc的稳定超表达可以促进小细胞肺癌细胞的失巢凋亡（细胞失去贴附引起的凋亡），进而抑制转移。而p66Shc在肺癌细胞自噬中的功能还有待进一步研究。
目的:
研究营养胁迫的肺癌A549细胞中，细胞自噬相关标志分子如LC3B，Beclin1，p62等的变化。在此基础上，探讨p66shc在细胞自噬中的功能;通过信号转导的研究，初步阐释p66Shc对细胞自噬的调控机制，为更加深入地了解p66shc的功能提供新的研究方向。本研究将为以p66Shc为靶点治疗肺癌提供理论依据，同时丰富对细胞自噬在肺癌细胞生物学中功能的认知。
方法:
首先利用慢病毒感染的实验方法产生失去功能和获得功能的稳定细胞系，即在A549细胞和BEAS-2B细胞中沉默p66Shc，在MCF-7细胞过表达p66shc。在营养胁迫条件下，通过Immunoblot的方法检测自噬标志分子LC3B，p62的变化，进一步研究信号通路分子如Erk1/2，Akt等的磷酸化水平以及凋亡相关的分子如cleaved caspases的变化。通过电转化表达RFP-LC3B，并在共聚焦显微镜下观察和计数LC3B的荧光斑点。使用细胞增殖以及细胞死亡试剂盒检测细胞在p66shc表达和沉默情况下的细胞增殖和死亡情况。GST-pulldown用于检测k-Ras在p66Shc表达和沉默情况下的活性。
结果:
(1)在A549细胞中，营养胁迫诱导p66Shc的蛋白和RNA表达水平均升高，p66Shc沉默降低营养胁迫诱导的细胞死亡。(2) p66Shc延缓营养胁迫诱导的细胞自噬:与对照细胞相比，p66shc沉默的A549细胞中共聚焦显微镜观察到的RFP-LC3B斑点数目在正常培养基或营养胁迫1天后均显著降低。正常培养的A549细胞在p66shc沉默后，LC3B-Ⅱ与LC3B-Ⅰ的蛋白水平的比值(LC3B-Ⅱ/Ⅰ)比对照降低了约3倍。在营养胁迫1天后p66shc沉默的A549细胞的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比对照降低了30％，营养胁迫3天后p66shc沉默的A549细胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比例与对照相比无显著差别。在不表达p66shc的MCF-7细胞中过表达p66shc提高了LC3B-Ⅱ/Ⅰ比例，自噬相关分子Atg5的沉默降低了LC3B-Ⅱ比例的水平但是并没有改变p66shc提高LC3B-Ⅱ/Ⅰ比例的趋势。在营养胁迫8h时，BEAS-2B细胞沉默p66shc导致LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例显著降低。(3)临床样本中p66shc与LC3B-Ⅱ的表达具有正相关性:在24例临床肺癌及其癌旁组织中，通过蛋白水平分析发现有15例组织的p66shc表达水平与LC3B-Ⅱ呈正相关。(4) p66shc沉默导致细胞增殖水平的降低，表明p66Shc沉默降低营养胁迫诱导的细胞死亡率不依赖于增殖水平的提高。营养胁迫可以导致p66shc沉默的以及对照A549细胞中的磷酸化Erk1/2水平的降低，但是随着胁迫时问的延长，p66shc沉默的细胞中磷酸化Erk1/2的水平升高，磷酸化Akt的水平降低。自噬早期抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)可以显著的提高磷酸化的Erk1/2的水平;而且，p66shc沉默导致k-Ras-GTP水平升高，Beclin1水平降低，但p62水平无显著变化。这些结果表明k-Ras-Erk1/2-Beclin1通路可能在p66shc影响自噬的过程中发挥重要的作用。(5)p66shc沉默导致cleaved caspase-7，PARP水平的降低，但是并不影响cleavedcaspase-6，-9的水平;表明沉默p66shc可降低caspase-7，PARP的活性，进而提高凋亡抗性。
结论:
在营养胁迫状态下，信号衔接蛋白p66shc促进细胞自噬水平升高;而沉默p66shc的肺癌细胞在营养胁迫状态下死亡率降低;这表明p66shc的沉默可以延缓细胞自噬水平并且增加凋亡抗性，这一延缓肺癌细胞自噬性死亡的过程可能由k-Ras-Erk1/2-Beclin1通路所介导。基于肺癌临床样本的统计数据也进一步证实了这一推测。本研究针对p66shc在肺癌细胞自噬中的功能和调控机制进行了探讨，研究结果将有助于丰富和完善细胞自噬这一复杂动态过程的调控机制。