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目的：通过杆状病毒昆虫表达系统，实现临床级重组腺相关病毒（rAAV）的制备。方法：将腺相关病毒（AAV）载体pAAV-MCS的两端反向重复序列（ITR）及目的基因表达框用限制性内切酶PciI和SfoI双酶切，得到大小约2053bp的目的片段，过胶纯化回收后用Klenow平端化处理。杆状病毒载体pFastBacDual用限制性内切酶KpnI和HindIII双酶切，过胶纯化回收得到4806bp的目的片段，通过Klenow和T4Polymerase平端化处理，用Solution I连接酶将两个片段连接到一起，构建成6859bp大小的顺式载体。经NdeI和HpaI双酶切和EcoRI单酶切鉴定，及DNA测序无误后命名为pBclAAV-MCS；为了检测两杆状病毒昆虫表达系统的可行性，设计正向引物EGFP-EcoRI-F和反向引物EGFP-Xbal-R经PCR反应从pIRES-EGFP中扩增得到大小约720bp的EGFP基因片段，因为pBcl AAV-MCS有同样的酶切位点EcoRI和XbaI，用Solution I连接酶将EGFP基因片段插入到pBclAAV-MCS的EcoRI和XbaI位点，经DNA测序正确后命名为pBcl AAV-EGFP。反式载体是利用真核细胞基因表达调控的遗漏扫描（leakyscanning）原理，在几个翻译起始部位引入ACG或CTG，这样一个启动子可以同时启动表达多个片段，将pAAV-MCS的衣壳蛋白（Cap1）和复制蛋白（Rep2）经PCR反应分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBacDual的启动子PP10和PPH下，命名为pBcl AAVCap/Rep。分别将顺式载体和反式载体转化到DH10BacTM感受态中，制备成重组杆状病毒颗粒Bacmid，经PCR鉴定正确后，分别命名为Bacmid AAV-EGFP和BacmidAAV-Cap/Rep。按照Invitrogen质粒提取步骤提取Bacmid DNA后分别用转染试剂脂质体CellfectinII包装，转染sf9细胞制备P1病毒，然后用P1扩增P2病毒，使病毒滴度达到约1012v.g./ml，用Bacmid AAV-EGFP和Bacmid AAV-Cap/Rep的P2病毒共感染昆虫细胞sf9完成rAAV的拯救和包装过程。最后rAAV感染293T细胞来检测其活性。结果：顺式载体由pAAV-MCS和pFastBacDual剪接嵌合而成，大小为6859bp，酶切鉴定及测序正确，命名为pBcl AAV-MCS，将EGFP引入其多克隆位点，来检测该系统的可行性，测序正确后命名为pBclAAV-EGFP；反式载体是利用真核基因遗漏扫描原理表达AAV的包装元件，其中衣壳蛋白是由同一mRNA、不同起始密码子和共同的终止子转录生产，复制蛋白包含Rep78和Rep52，起始密码子分别是AUG和CUG，将衣壳蛋白和复制蛋白这两个基因表达片段经PCR反应连接到相应的限制性内切酶位点，分别克隆到杆状病毒载体pFastBacDual的启动子PP10下的KpnI和XhoI位点和PPH下的HindIII和BamHI位点，经DNA测序正确后命名为pBcl AAV Cap/Rep。此后将顺式载体和反式载体分别再转化到DH10BacTM感受态细胞中，转座形成杆粒Bacmid、在悬浮培养的昆虫sf9细胞中制备成杆状病毒，病毒滴度可达1-3x1012v.g./ml。然后用二杆状病毒共感染sf9细胞，完成rAAV-EGFP的拯救、复制和包装过程，经感染293T细胞测试具有良好的生物学活性。结论：该系统克服了常规rAAV制备的限制性因素，为临床级基因治疗用病毒的制备提供了实验依据，为rAAV的基因治疗打下了良好的基础。