论文部分内容阅读
真核微藻—小球藻特别是蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）生长快、固碳速率高，且富含蛋白、油脂和色素等生物活性成分，近年来已成为微藻营养品、微藻能源、微藻固碳及废水的微藻处理等方面研究开发中的主要藻种。通过基因工程手段可有效提高微藻的光合固碳能力和油脂产率，有助于推动微藻能源、微藻固碳及废水处理的产业化。此外，由于小球藻可以直接食用，使用转基因小球藻表达外源重组蛋白，特别是饲料或饵料用外源蛋白可以不经过分离提取直接使用，具有重要的应用价值。 本实验室保有一株工业用蛋白核小球藻，利用本实验室在微藻培养领域首创的异养-稀释-光诱导串联培养平台技术，目前已经成功实现了藻粉的工业化生产，其异养培养的平均生长速率不低于3 g/L/h，不低于现有任何其它外源基因表达系统。此外，本实验室在国内外首次完成了该藻株的全基因组及转录组测序，遗传背景清楚，但迄今未见有关该藻遗传改造方面的报道，亟待深入研究。 本文采用pGreenⅡ系列载体，首先构建了由Ubiquitin启动子启动EGFP的表达载体，用G418进行抗性筛选，探索并系统优化了电穿孔法转化蛋白核小球藻的方法，初步建立了筛选、鉴定转化藻株的方法;在此基础上，探索了用2A肽共表达NptⅡ和EGFP基因的可行性，并初步比较了三种2A肽的“剪切”效率以及四种不同来源启动子启动外源基因表达的效率。 使用对数生长前期的小球藻细胞，在初始细胞密度5×106个/皿，质粒浓度30μg/mL、脉冲电压660 V、脉冲时程3.5 ms、30μg/mL G418的筛选浓度下可获得较好的转化效果，1μg质粒的转化效率为10.7个/106。获得的转化藻株经过筛选纯化后，在DNA水平成功鉴定到抗性基因NptⅡ和EGFP基因;使用荧光显微镜和流式细胞仪鉴定，成功在转化株中观察到高强度的绿色荧光，上述结果证明转化藻中外源基因是稳定整合的且可以表达。 初步实验结果表明采用pGreenⅡ0000-promoter-NptⅡ-2A-EGFP-terminator质粒方案，来共表达抗性基因和目的基因是可行的。三种2A肽的“剪切”效率从高到低依次是T2A、P2A和F2A;内源性Hsp70A启动子更适合在蛋白核小球藻中表达外源基因，农杆菌Nos和玉米Ubiquitin启动子适中，衣藻Hsp70A-RbcS2双重启动子较差。 本文在国内外首次建立了用途广泛的蛋白核小球藻的外源基因表达系统，并使用2A肽一次性共表达两个蛋白;开发的内源性Hsp70A启动子对高效表达外源基因具有重要作用。上述结果为通过基因工程手段改造蛋白核小球藻，将其打造成微藻能源（固碳）的工业模式藻株，并开发成高效率低成本的新型生物反应器带来了希望，为进一步研究奠定了良好的基础。