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心肌缺血是心源性猝死的主要原因。细胞自噬被证明在心肌缺血再灌注损伤中起到保护心肌的作用。D942是一种小分子物质,它能强烈激活肿瘤细胞中AMPK的活性；而姜黄素能阻断肿瘤细胞的mTOR信号通路。既然AMPK能诱导细胞自噬,而mTOR抑制细胞自噬,因此,本研究通过心肌细胞OGD/R模型及在体结扎冠状动脉再灌注模型来研究应用D942与姜黄素是否能促进细胞自噬从而保护缺血心肌。第一部分：D942及姜黄素对体外氧糖剥夺-再灌注心肌细胞的保护作用研究采用差速贴壁方法分离培养乳鼠心肌细胞,利用缺氧复氧培养模拟离体缺血再灌注损伤。姜黄素及D942干预正常培养心肌细胞,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,观察药物对心肌细胞的毒性反应；在氧糖剥夺-再灌注模型中,利用流式细胞仪定量检测心肌细胞自噬率的变化,Western blot检测自噬相关蛋白LC3B的转化和p62的水平,考察姜黄素及D942对心肌细胞自噬的激活作用以及自噬阻断剂氯喹是否取消了药物的心脏保护作用；通过Compound C和pervanadate干预AMPK和mTOR通路,证明姜黄素及D942是否分别通过AMPK和mTOR途径来激活自噬,从而起到保护心肌的作用。结果显示：心肌细胞经用D942及姜黄素处理后,MTT法检测各组心肌细胞活力结果显示：干预组明显高于缺血再灌注组,LDH检测结果显示干预组明显低于缺血再灌注组,说明D942及姜黄素减轻缺血再灌注所致的心肌细胞损伤,改善心肌细胞活力。MDC检测自噬率、流式细胞仪进行自噬细胞定量检测以及FITC-Annexin V/PI法检测细胞凋亡、Western blot检测自噬相关蛋白(LC3BⅡ、p62)发现两种药物都能诱导再灌注后心肌自噬,减少心肌细胞凋亡,尤其是两者连用时；加入氯喹后,抑制了两种药物的自噬诱导作用。说明D942及姜黄素是通过诱导自噬起到心肌损伤保护作用的。D942处理组细胞的AMPK及ACC磷酸化水平明显比其他组高。D942及姜黄素均降低了p70S6激酶的磷酸化水平,同时真核细胞转录启动因子4EBP1呈激活状态,说明mTOR途径被抑制了；给予compound C后,LC3B-Ⅱ的转化受到D942的抑制,而P62蛋白水平不受影响,这说明D942确实通过AMPK途径诱导了自噬；姜黄素的诱导自噬作用被过钒酸盐阻断了,说明mTOR途径在姜黄素诱导细胞自噬中起了关键性作用。第二部分：D942及姜黄素对在体心肌缺血-再灌注损伤的影响正常小鼠尾静脉注射姜黄素及D942,上述方法检测心肌细胞自噬水平及AMPK和mTOR通路相应位点磷酸化水平,观察药物对小鼠体内自噬的影响及机制；采用结扎小鼠冠状动脉前降支模拟心肌缺血以及松解结扎线模拟再灌注的方法,建立在体缺血再灌注损伤模型,通过尾静脉注射姜黄素及D942,分离心肌细胞,利用流式细胞仪检测心肌细胞自噬率,Western blot检测自噬相关蛋白LC3B的转化及p62的水平,RT-PCR检测Beclin-1的mRNA表达水平,考察姜黄素及D942对心肌细胞自噬的激活作用；生化方法检测血清LDH水平；TTC染色检测心梗面积,明确姜黄素及D942对在体心肌缺血-再灌注损伤的影响。结果显示：通过结扎冠状动脉方法建立缺血再灌注模型,小鼠尾静脉注射D942及姜黄素,Western blot检测发现药物处理组小鼠心肌LC3B-Ⅱ水平提高了而p62水平有所下降,RT-PCR方法检测证明药物处理组小鼠心肌Beclinl的mRNA表达量增高,说明D942及姜黄素在体内诱导了细胞自噬。通过TTC染色测定各组小鼠心肌梗死面积,结果发现缺血再灌注组(29.3±4.7%)心肌梗死面积明显高于药物处理组(18.2±3.1%)(P<0.05),表明D942及姜黄素能够保护心肌细胞受缺血再灌注损伤。全自动生化分析仪检测血清LDH结果同样证明这种保护作用。综上所述,本课题所得结论如下：D942或姜黄素提高了缺血再灌注心肌的存活；D942与姜黄素促进了细胞自噬,通过激活AMPK通路或抑制mTO通路；抑制这种细胞自噬则失去了细胞保护作用说明D942与姜黄素诱导的细胞自噬是心肌细胞保护的主要原因。联用D942与姜黄素显示了更强大的细胞自噬诱导及心肌保护作用。