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Ro60(TROVE domain family,member 2,TROVE 2)是免疫疾病系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)患者的自身免疫抗原,并且与多种免疫疾病的发生密切相关。Ro60抗原联合一系列连锁的自身抗原,如Ro52(52 KDa Ro protein,Ro52)、干燥综合征抗原B(Sjogren’s Syndrome antigen B,SSB)等,这些自身抗原或是临床上重要的可提取细胞核抗原家族成员,或是在狼疮(Lupus)、原发性干燥综合征(primary Sjogren’s Syndrome,pSS)等免疫疾病中充当关键性的生物标志物。流行病学的调查研究发现,SLE患者中肿瘤易感。但是Ro60与肿瘤发生的关系一直不清楚。针对7个国家9547例系统性红斑狼疮患者展开的临床数据调查结果发现,系统性红斑狼疮患者恶性肿瘤发生率和进展速度均远高于正常人群。此外,还有研究发现抗Ro60抗体阳性的自身免疫疾病患者比抗Ro60抗体阴性的患者肿瘤发生率显著增高。到目前为止,大量研究已证实Ro60的异常与肿瘤之间存在联系,但有关Ro60在肿瘤中的具体功能和作用的分子机制却鲜有研究和报道。我们实验室前期通过对肿瘤组织芯片进行Ro60蛋白免疫组化分析发现,Ro60蛋白在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤组织中高表达,特别是在肺癌组织和癌旁组织中Ro60蛋白表达水平有显著差异。为了深入全面阐释作为自身抗原在多种免疫相关疾病中发挥作用的Ro60蛋白表达异常是如何在肿瘤发生发展中起作用的,我们以发病率与死亡率一直居高不下的非小细胞肺癌A549细胞作为研究对象,探讨Ro60蛋白在非小细胞肺癌细胞中的功能和作用机制。目的:以非小细胞肺癌A549细胞为主要研究对象,明确Ro60表达改变、调控异常与非小细胞肺癌发生发展相关性,具体而言即研究Ro60是否参与非小细胞肺癌A549细胞的增殖、侵袭转移等肿瘤的发生发展过程。在基因芯片(gene chip)检测分析的基础上结合细胞生物学、分子生物学等实验技术,分析验证Ro60在非小细胞肺癌中的功能及功能发挥所依赖的分子信号网络途径,揭示Ro60与非小细胞肺癌发生发展的内在关联,为非小细胞肺癌的基础研究和临床治疗提供新的思路和理论依据。方法:(1)采用干涉RNA技术在非小细胞肺癌A549细胞中敲低Ro60表达,建立敲低表达Ro60蛋白的A549细胞模型,利用CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒、克隆形成实验和流式细胞术检测明确Ro60对A549细胞增殖活力、克隆形成能力和细胞周期的影响;通过细胞划痕实验、transwell细胞迁移实验和细胞侵袭实验分别检测下调ro60蛋白表达对非小细胞肺癌a549细胞运动、细胞迁移、细胞侵袭能力的影响。(2)采用基因芯片技术检测非小细胞肺癌a549细胞和rna干涉下调ro60表达的a549细胞的mrna表达谱,分析筛选差异表达基因,采用生物信息学方法对差异表达基因进行功能富集分析。结合功能效应锁定相关的信号调控通路,并通过反转录实时定量pcr技术、免疫印迹等实验方法验证上述锁定的信号通路中重要功能分子的变化;以放线菌素d(dactinomycind)抑制mrna的合成,检测ro60对重要分子p21mrna稳定性的影响;利用双萤光素酶活性报告基因系统检测分析相关基因转录因子p53对下游分子启动子区dna转录功能活性的变化。采用实时定量pcr和westernblot检测下调ro60蛋白表达对包括src和基质金属蛋白酶9表达的影响。结果:(1)在a549细胞中敲低ro60表达,cck-8细胞增殖-毒性检测试剂盒检测的非小细胞肺癌a549细胞增殖活力降低,a549细胞克隆形成能力减弱,a549细胞细胞周期分布发生改变,即g1期细胞数量增多,s期细胞数量减少,出现g1期阻滞现象。通过细胞划痕实验和transwell实验检测到a549细胞运动、细胞迁移和细胞侵袭能力均随着ro60蛋白表达的下调而减弱。(2)基因芯片检测a549细胞和下调ro60表达的a549细胞的mrna表达谱结果表明,ro60的表达对a549细胞基因表达产生影响。ro60表达下调a549细胞与对照组细胞相比下调基因数量较上调基因多,其中上调2倍以上的基因有192个,下调2倍以上的基因有374个。采用生物信息学方法对差异表达基因进行生物途径富集分析和go富集分析,发现ro60基因除了影响与系统性红斑狼疮等疾病相关的免疫通路基因表达外,ro60基因的表达还可能在细胞周期、dna复制、细胞粘附、肿瘤信号转导通路等分子信号网络中发挥调控作用。这些受ro60表达影响的基因中包括与细胞增殖、细胞周期和肿瘤细胞侵袭转移相关的p21和基质金属蛋白酶(matrixmetallopeptidases,mmp)等功能分子。(3)在a549细胞中下调ro60表达后,细胞周期相关分子p21在mrna和蛋白表达水平均出现上调;与肿瘤侵袭转移相关的c-src和mmp9等在mrna水平显著降低,免疫印迹结果显示src蛋白表达下调,mmp9蛋白整体表达水平没有明显变化,但mmp9酶原激活形式蛋白含量出现了显著下调,这一结果与ro60影响非小细胞肺癌a549细胞的侵袭和转移行为相一致。结论:免疫疾病相关自身抗原ro60与肿瘤发生发展相关联,在多种肿瘤组织中表达量升高,尤以在肺癌组织的表达差异最为显著。在细胞水平,ro60基因表达下调影响非小细胞肺癌a549细胞增殖活力、克隆形成能力和细胞周期分布,以及A549细胞的运动、迁移和侵袭能力。在分子水平,Ro60基因表达下调对非小细胞肺癌A549细胞基因表达谱产生影响,受Ro60表达影响的基因功能涉及细胞免疫、细胞周期和肿瘤侵袭转移等信号通路。Ro60表达影响A549细胞的细胞周期改变与Ro60影响p21表达相关;下调Ro60表达抑制A549细胞的迁移和侵袭能力与Src蛋白表达水平和MMP9蛋白的酶原激活相关。上述研究结果对阐明Ro60在肿瘤发生发展中的作用机制提供了基础。