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糖尿病是一种由于机体胰岛素分泌绝对或相对不足而引起高血糖的代谢性疾病。长期高血糖可引发一系列以血管病变和神经病变为基础的多个系统的慢性并发症,导致患者残疾或死亡,严重危害人类的健康。糖尿病在西方发达国家具有很高的发病率;流行病学研究表明,在经济发展迅速、人民生活水平大幅度提高的发展中国家,糖尿病发病率也呈快速上升的趋势。抗糖尿病药物的研发已为世界所瞩目,在经济快速发展且人口众多的我国更是攸关民生经济的一项大课题。
糖尿病在临床上主要分为1型(胰岛素依赖型)和2型(非胰岛素依赖型),其中2型糖尿病占了90％以上。2型糖尿病可通过口服降糖药物来降低血糖,通过药物有效控制血糖可延缓糖尿病并发症的发生和进展。目前市场上常用的口服抗糖尿病药物从作用机制上主要可分为以罗格列酮为代表的胰岛素增敏药,以二甲双胍为代表的糖代谢改善药,以阿卡波糖为代表的α-葡萄糖苷酶抑制药,以格列本脲为代表的胰岛素促分泌药等多种类型,这些药物虽然能控制血糖,但仍存在长期疗效不佳和不良反应等方面的缺点。传统中药有效成分的提取分离工作正受到世界各国的广泛关注,从中药中提取有效抗糖尿病部位或单体,为新药的发现提供了有效手段;组合化学和计算机辅助设计等新手段的应用,加快了候选新药的出现。在这样的形势下,抗糖尿病药物药效学研究手段有必要从传统单一的体内实验筛选转入体外和体内筛选相结合的方式。
采用整体动物研究新药的抗糖尿病作用的优点是可以直接观察到药物对血糖的影响,但对初步活性筛选而言,却存在所需样品量大,需要使用大量动物等缺点。采用体外模型筛选抗糖尿病药物,需要的样品量少;在提示药效的同时,同时也阐明了药物的作用机制;还可据此进行更为深入的细胞分子水平的相关研究;另外,机制的阐明也可以为整体动物实验方案的设计提供参考。因此,在筛选数目较多的微量受试样品时,体外模型具有体内模型无法比拟的优势。然而,药物的体外抗糖尿病活性最终还是要通过整体动物实验进行药效的验证。由此可见,当前的抗糖尿病药物筛选宜根据受试样品的种类和数量以及研究目的等情况,选取合适的体内外多种模型进行综合地研究。
本研究从药物抗糖尿病的各种可能机制入手,结合该领域的研究进展,利用各种可传代的药物作用靶细胞株或重组的蛋白,对中药有效部位或新合成化合物进行抗糖尿病活性筛选和进一步深入研究,并进行必要的体内药效学验证。本研究旨在阐明特定药物的抗糖尿病作用及其机制,并为抗糖尿病新药的研发建立一个科学的实验体系。
第一章水菖蒲根抗糖尿病活性部位筛选及药效学研究
天南星科植物水菖蒲(AcorusCalamusL.)根治疗糖尿病在美洲和印度尼西亚(印尼)民间流传已久,但至今未见对水菖蒲根进行系统的抗糖尿病作用的实验研究。本文利用现代药理学实验方法,首先利用体外抗糖尿病筛选模型,从药物抗糖尿病的三种主要作用机制入手,对印尼来源的水菖蒲根的抗糖尿病活性部位进行筛选和研究;其次,对水菖蒲根抗糖尿病活性部位进行体内药效学验证;最后,对水菖蒲根抗糖尿病的有效部位作进一步分离和成分分析。
1、基于作用机制的水菖蒲根活性部位体外筛选和研究
采用3T3-L1前脂肪细胞分化模型,研究水菖蒲根醇提物的不同极性溶剂萃取部位的促脂肪细胞分化作用,并进一步研究活性部位对脂肪细胞葡萄糖转运子-4(glucosetransporter-4,GLUT4)蛋白表达水平的影响,对胰岛素信号转导途径中关键蛋白胰岛素受体底物-1(insulinreceptorsubstrate-1,IRS-1)及其磷酸化蛋白(p-IRS-1)表达的影响,以及对细胞周期和凋亡的影响,初步阐明ACE促进脂肪细胞分化的分子机制;采用L6大鼠骨骼肌细胞研究活性部位对胰岛素介导的葡萄糖消耗的影响。采用HIT-T15细胞胰岛素分泌模型,研究水菖蒲根醇提物的不同极性溶剂萃取部位的促胰岛素分泌作用。采用α-葡萄糖苷酶动力学实验,研究水菖蒲根各个萃取部位的α-葡萄糖苷酶抑制作用。
2、水菖蒲根乙酸乙酯部位抗糖尿病作用的体内研究
针对ACE的胰岛素促分泌作用,采用正常动物进行降血糖实验和葡萄糖耐量实验;针对ACE的α-葡萄糖苷酶抑制作用,采用正常动物进行了淀粉耐量实验;针对ACE的胰岛素增敏作用,采用遗传性糖尿病动物db/db小鼠,通过对各项糖尿病相关指标的测定,研究其抗糖尿病作用及机制。
3、水菖蒲根乙酸乙酯部位分离组分的活性筛选和成分分析
本部分首先对ACE的进一步分离组分进行体外活性筛选,经3T3-L1脂肪细胞促分化实验,油红O染色法结果显示ACE和ACE3、ACE4、ACE5251μg/ml均可明显增加3T3-L1细胞内脂肪含量(P＜0.05),提示ACE的胰岛素增敏作用的活性成分主要存在于ACE3～ACE5的组分中。HIT-T15细胞胰岛素分泌实验表明,ACE及其分离组分ACE1和ACE412.50μg/ml可明显增加24h累积胰岛素分泌量(P＜0.05),提示ACE中具有促进胰岛素分泌作用的成分主要存在于ACE1和ACE4中。ACE及其分离组分1mg/ml对α-葡萄糖苷酶均有不同程度的抑制作用,其中ACE和ACE5对α-葡萄糖苷酶的抑制作用最强,ACE2～ACE4具有中等强度的抑制作用,ACE1的酶抑制作用最弱。提示α-葡萄糖苷酶抑制作用强的成分主要存在于ACE5中,而很少存在于ACE1中。
经鉴定,ACE中的主要成分包括β-细辛醚、棕榈酸、10-甲氧基异菖蒲二醇、β-谷甾醇、5-羟基.7,8,3',4'-四甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-7,8-二甲氧基黄酮、3β,22α,23-三羟基齐墩果烷-30-甲氧羰基-12-烯-22-O-α-L-鼠李糖苷、β-胡萝卜苷等8种化合物。其中,10-甲氧基异水菖蒲二醇是新化合物,5-羟基-7,8,3',4'-四甲氧基黄酮和5,4'-二羟基-7,8-二甲氧基黄酮是本属首次发现。根据ACE分离组分的HPLC分析,ACE1中的主要成分是β-细辛醚,ACE4和ACE5中的主要成分为5-羟基-7,8,3',4'-四甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-7,8-二甲氧基黄酮、3β,22α,23-三羟基齐墩果烷-30-甲氧羰基-12-烯-22-O-α-L-鼠李糖苷和β-胡萝卜苷。实验证实β-胡萝卜苷无脂肪细胞促分化作用。
本章结论:
1、水菖蒲根乙醇提物的乙酸乙酯部位(ACE)具有明显的体外抗糖尿病活性。ACE具有体外胰岛素增敏作用,首先表现为促3T3-L1脂肪细胞分化作用,这与其促进分化过程中胰岛素信号蛋白IRS-1及其磷酸化蛋白p-IRS-1以及GLUT4蛋白的表达有关;还表现为增加胰岛素介导的L6骨骼肌细胞葡萄糖消耗。另外,ACE可刺激HIT-T15细胞分泌胰岛素,还可抑制α-葡萄糖苷酶活性,其IC50为0.41mg/ml,酶抑制类型为混合型。
2、ACE灌胃给药具有明显的体内抗糖尿病活性。ACE400、800mg/kg对正常小鼠具有短暂的降血糖作用,并改善葡萄糖耐量。ACE100mg/kg可改善正常小鼠的淀粉耐量。ACE100mg/kg连续给药可降低肥胖2型糖尿病db/db小鼠的血糖、血清甘油三酯水平,与罗格列酮合用还可增强罗格列酮的降低胆固醇作用;ACE对db/db小鼠的抗糖尿病作用与其降低血清游离脂肪酸水平、升高血清脂联素水平,改善机体胰岛素敏感性有关;ACE可改善db/db小鼠多饮多食的症状,同时不出现噻唑烷二酮类胰岛素增敏药所常见的体重增加的副作用;ACE还可改善db/db小鼠胰岛和肝脏组织的形态学表现。
3、ACE中兼具胰岛素增敏、胰岛素促分泌及α-葡萄糖苷酶抑制作用的成分可能是5-羟基-7,8,3',4'-四甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-7,8-二甲氧基黄酮和3β,22α,23-三羟基齐墩果烷-30-甲氧羰基-12-烯-22-O-α-L-鼠李糖苷。
第二章异丁酸酯类新化合物YY20胰岛素增敏作用的体外研究
本文在细胞水平上研究非噻唑烷二酮类新型过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)激动剂异丁酸酯类化合物YY20的体外胰岛素增敏作用。通过前脂肪细胞分化实验检测YY20激动PPARγ的生物活性;采用逆转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和western印迹法检测YY20对胰岛素诱导的3T3-L1前脂肪细胞分化过程中靶基因和靶蛋白表达的影响,并观察PPARγ特异性抑制剂对YY20作用的影响;采用葡萄糖氧化酶法检测YY20对HepG2人肝癌细胞和L6大鼠骨骼肌细胞经胰岛素介导的葡萄糖消耗的影响。
结果表明,YY20能明显促进胰岛素诱导的3T3-L1前脂肪细胞分化,并上调PPARγ2基因以及相关蛋白IRS-1、GLUT4和脂联素的表达,这种上调作用能被PPARγ抑制剂SR-202所逆转。YY20给药24h和48h可显著增加HepG2细胞和L6细胞的葡萄糖消耗量(P＜0.05和P＜0.01),且呈一定的浓度依赖性和胰岛素依赖性。这些作用与阳性对照药罗格列酮相似。
本章结论:YY20可促进胰岛素诱导的3T3-L1前脂肪细胞分化,上调PPARγ2mRNA及IRS-1、GLUT4和脂联素蛋白的表达;YY20促脂肪细胞分化作用可被PPARγ抑制剂逆转;YY20可浓度依赖性地增加胰岛素介导的HepG2肝细胞和L6骨骼肌细胞的葡萄糖消耗,可能具有与罗格列酮类似的胰岛素增敏作用。