斑点叉尾鮰天然Fab噬菌体抗体库的构建

• 作 者: 赵琳
• 机 构: 华中农业大学
• 出 处: 华中农业大学
• 发表日期: 2009年期
• 关键词: 噬菌体表面展示 斑点叉尾鮰 天然Fab抗体库

噬菌体抗体库技术是近年来抗体技术研究中革命性的进展,利用此技术能够快速有效地制备人源化抗体,并且可以筛选到具有高亲和力的特异性抗体。目前此项技术在水产养殖业中尚未见报道,基于斑点叉尾鮰抗体基因研究比较清楚,本文构建了其天然噬菌体抗体库,具体工作如下:1引物设计斑点叉尾鮰重链可变区分为13个VH家族,针对每个VH家族设计1对特异性引物,共13对。轻链有两种类型,F链和G链,由于轻链基因序列同源性很高,因此每种类型设计1对引物,共2对。所有引物两端都带有限制性酶切位点,5’引物位于免疫球蛋白可变区前导肽和N端第一骨架区(FR1),3’位于CH1或CL末端。2轻链库的构建取50尾健康斑点叉尾鮰新鲜外周血共250mL,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录获得cDNA。PCR扩增抗体重链Fd和轻链基因片段,回收约650bp的抗体片段。将回收的PCR产物连接T载体(pT-Fd,pT-L),分别用SacI+XbaI,SpeI+XhoI酶切,再次回收重链Fd和轻链基因片段。将第二次回收的轻链基因片段插入噬菌粒载体p3MH,重组后电转化大肠杆菌XL1-BLue,构建轻链库p3MH-L。取适量电转化后的菌液铺板培养,统计转化子数,计算库容。经过多次转化轻链库库容达到5.10×10~7。随机挑取20个菌落,菌液PCR,电泳显示18个菌落可见约650bp的轻链基因条带,轻链库重组率为90%。将质粒p3MH-L经过SacI+XbaI酶切可见约650bp的插入片段,说明轻链库构建成功。3抗体库的构建将轻链库质粒p3MH-L经SpeI+XhoI双酶切,回收载体大片段(约4.1kb),将其与第二次回收的重链Fd段基因连接,转化大肠杆菌,按构建轻链库的方法计算转化率和插入效率。经过4次转化最终得到总库容为5.67×10~7的抗体库(p3MH-L-Fd),插入效率为90%。抗体库质粒经XhoI单酶切,SpeI+XhoI双酶切后可见插入的目的片段,说明抗体库构建成功。4抗体库多样性分析将构建的抗体库菌液铺平皿后随机挑取单菌落,摇菌后测定重链Fd和轻链基因序列,进行序列对比,分析抗体库多样性。共测定10条重链Fd段基因序列和6条轻链基因序列,结果显示扩增的Fd段和轻链基因结构完整,抗体多样性良好。