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光敏核不育水稻农垦58S系已故农学家石明松先生发现的一种晚粳水稻品种农垦58N的自然突变株,它在一定温度范围内表现出长日照(LD)下不育和短日照(SD)下可育的光周期育性转换的遗传特性,为在农业生产中按照“两系法”途径利用杂种优势提供了可能性。
本实验室采用改良的mRNA差异显示技术从光敏核不育水稻农垦58S-LD中分离到一个发育调节基因OsRacD,它属于RAS超家族Rho/Rac亚族的小分子量GTP结合蛋白编码基因。
绒毡层是花药壁的最内层,直接与发育中的小孢子相接触,在小孢子发育过程中起着重要的作用,绒毡层提早或延迟降解都会导致雄性不育。绒毡层可以分泌各种物质提供给小孢子发育需要,当小孢子母细胞减数分裂接近完成时,它开始出现退化的迹象,在小孢子后期或雄配子体阶段,绒毡层细胞仅留残迹或已不存在。绒毡层的降解是细胞程序性死亡(PCD,programmed cell death)的过程。
OsRacD基因在可育材料58N及58S-SD中表达量高,在不育材料58S-LD中表达量低。OsRacD基因在根、茎、叶、花等多种组织、器官中组成型表达,RNA原位杂交表明它在花药绒毡层中有表达。转反义OsRacD的水稻58N花药短小弯曲并且表面皱缩,表现出瘦小、萎缩的形态,并且转基因花药中绝大部分花粉粒形状不规则,I2-KI无法染色,透明,属于典败(染色透明,形状不规则)或圆败(染色透明,圆形)等花粉败育类型。转反义植株的自交结实率显著下降,反义抑制效果明显的株系,其自交结实率也相应更低,二者具有相关性。细胞形态学观察表明,在次生造孢细胞时期,转反义植株花药的次生造孢细胞以及四层花药壁细胞,与野生型相比没有明显差异;但是,当小孢子母细胞减数分裂完成,发育至单核收缩期时,绒毡层显现异常,表现为没有退化迹象,肥大生长,排列规则并伴随有液泡化;小孢子在从四分体中释放出来后,也逐渐萎缩。绒毡层特异表达基因(Cp1,Osc4和Osc6)在转反义植株中的表达量也呈现不同程度下调。TUNEL分析表明,正是因为绒毡层PCD的延迟,导致绒毡层无法正常降解。
分别以野生型和组成型激活的OsRacD为诱饵,通过酵母双杂交筛选农垦58N水稻幼穗cDNA文库,在获得的阳性克隆中,有两个我们比较感兴趣的蛋白OsMAPK14和OsRLK。酵母回转及体外GST pull down实验表明,OsRLK与野生型OsRacD和组成型激活的OsRacD在酵母体内及体外均可相互作用,但是,与另一小GTPase OsRacB之间不存在相互作用。RT-PCR及全基因组芯片显示,这两个基因在多种组织具有广泛的表达,在58N及58S-SD、58S-LD幼穗中也有表达。OsMAPK14及OsRLK RNAi转基因植株的结实率均正常,推测与水稻多基因家族存在功能冗余有关。
以上结果表明,OsRacD基因可以促进花药绒毡层细胞程序性死亡,它对绒毡层的降解以及小孢子发育是极其重要的;OsRacD可以分别与OsMAPK14和OsRLK在酵母体内及体外相互作用。