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牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属。BVDV不仅感染牛,同时对山羊和绵羊均存在持续性感染。给我国乃至全球的养殖产业带来了严重的经济损失。BVDV之所以无法消除,一个重要的原因就是持续性感染(PI)动物的存在。考虑到PI动物为病毒传播提供了重要的条件,控制BVDV的关键因素是识别和消除PI动物。自从1993年,Hamers-Casterman等报道在骆驼体内存在一种天然缺失轻链的抗体,并将其命名为纳米抗体以来,纳米抗体具有一些传统抗体所不具备的特性,如高水溶性、稳定性强、抗原识别能力强、免疫原性低、穿透性强等诸多优点,这使纳米抗体在生物学领域得到了广泛的应用。目的:旨在建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)ELISA检测方法。方法:(1)构建BVDV-E0表达载体,用BVDV-E0重组蛋白作为包被抗原,在96微孔板上进行方阵滴定实验,优化间接ELISA条件。(2)以BVDV-E0蛋白作为目标抗原,对扩繁得到的噬菌体展示文库进行三轮“吸附-洗脱-扩增”亲和筛选,挑取纳米抗体单克隆进行ELISA检测和序列分析。(3)构建原核表达载体pET-30a-Nb1和pET-30a-Nb2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得Nb1和Nb2原核表达蛋白。(4)通过WB来验证其与重组蛋白E0及BVDV病毒的结合能力,利用ELISA检测其亲和力及活性。将纳米抗体加入MDBK细胞验证其对细胞毒性。(5)用纯化的重组蛋白E0免疫家兔和羊驼,分别获得免疫后的兔血清和羊驼血清。将其与纳米抗体Nb1组装成双抗夹心ELISA体系,用于检测BVDV抗原。结果:(1)用间接ELISA方法对收集的88头份血清样品进行检测,检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到84%。(2)经过辅助噬菌体M13K07拯救后的文库滴度约为4.3×10~8 cfu/mL,经过三轮―吸附-洗脱-扩增的筛选后,得到2个单克隆经ELISA鉴定均为阳性。(3)成功构建原核表达载体pET-30a-Nb1和pET-30a-Nb2,并且获得重组蛋白Nb1和Nb2。(4)纳米抗体Nb1和Nb2能够与BVDV病毒发生特异性结合。细胞实验显示Nb1和Nb2对MDBK细胞有毒性作用。(5)初步建立基于纳米抗体的检测方法,该方法需要进一步优化。结论:利用BVDV-E0建立一种检测BVDV抗体的间接ELISA检测方法。成功淘选到2个与BVDV特异结合的纳米抗体,纳米抗体对MDBK细胞具有毒性。初步探索了基于纳米抗体的BVDV ELISA检测方法,为BVDV的检测提供了新材料。