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目的:近年来溶瘤病毒疗法被认为是最有前景的癌症治疗方法之一。研究表明,多种溶瘤病毒在体外或体内通过诱导肿瘤细胞特异性凋亡或自噬,抗肿瘤免疫等发挥抗肿瘤作用。本课题组在前期工作中发现,本实验室分离的仙台病毒Tianjin株(Sendai virus strain Tianjin)经紫外线灭活后可诱导人宫颈癌细胞HeLa凋亡。本论文拟在此基础上,进一步检测紫外线灭活的仙台病毒Tianjin株(以下简称UV-Tianjin)诱导HeLa细胞自噬发生及其初步机制、HeLa细胞自噬与凋亡之间的关系、以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)在UV-Tianjin诱导的自噬和凋亡中的作用,从而为仙台病毒抗肿瘤作用机制研究奠定理论和实验基础。方法:(1)我们首先研究了UV-Tianjin诱导自噬发生及其初步机制:用GFP-LC3质粒转染HeLa细胞,然后感染不同滴度的UV-Tianjin,在共聚焦显微镜或荧光显微镜下观察Hela细胞产生自噬情况;Western Blot检测不同滴度UV-Tianjin感染的HeLa细胞中,自噬标志物微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况以及自噬经典通路PI3K/Akt/m TOR中PI3K、Akt和m TOR的磷酸化水平。(2)接下来,我们探讨了UV-Tianjin诱导的HeLa细胞自噬和凋亡之间的关系:(1)将自噬抑制剂3-MA预处理的HeLa细胞感染UV-Tianjin(MOI:80)后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western Blot检测细胞中PARP和caspase-3的表达水平;(2)将凋亡抑制剂Z-VAD-FMK预处理的HeLa细胞感染UV-Tianjin(MOI:80)后,在荧光显微镜下观察自噬产生情况;Western Blot检测细胞中LC3表达水平。(3)最后,我们探究了ROS在UV-Tianjin诱导的自噬和凋亡中的作用:(1)荧光显微镜和流式细胞仪检测不同滴度UV-Tianjin感染的HeLa细胞内ROS生成水平;(2)将抗氧化剂NAC预处理的HeLa细胞感染UV-Tianjin(MOI:80)后,流式细胞仪检测ROS生成水平;荧光显微镜下观察自噬产生情况;Western Blot检测细胞中LC3的表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western Blot检测细胞中PARP和caspase-3的表达水平。结果:(1)UV-Tianjin诱导自噬发生及其初步机制:共聚焦显微镜观察显示,红绿荧光merge后的红色荧光小点明显增多,提示自噬流形成;荧光显微镜下观察发现,UV-Tianjin处理的HeLa细胞中绿色荧光斑点明显增多,且具有剂量依赖性趋势;Western Blot结果表明,随着UV-Tianjin滴度的增加,LC3-II的表达水平上调(P<0.05),而p-m TOR、p-PI3K、p-Akt的表达水平下调(p<0.01)。(2)UV-Tianjin诱导的HeLa细胞自噬和凋亡之间的关系:流式细胞仪检测结果表明,与病毒对照组相比,3-MA预处理的HeLa细胞凋亡率显著升高(p<0.05);Western Blot结果显示,3-MA预处理的HeLa细胞中cleaved PARP和cleaved caspase-3的表达水平上调(p<0.05);荧光显微镜观察发现,与病毒对照组相比,Z-VAD-FMK预处理的HeLa细胞中绿色荧光斑点明显增多;Western Blot结果显示,Z-VAD-FMK预处理的HeLa细胞中LC3-II的表达水平上调(p<0.05)。(3)ROS在UV-Tianjin诱导的自噬和凋亡中的作用:荧光显微镜和流式细胞仪检测均显示,UV-Tianjin感染的HeLa细胞中ROS含量呈剂量依赖性升高;且与病毒对照组相比,NAC预处理的HeLa细胞中ROS生成明显被抑制;荧光显微镜下发现,与病毒对照组相比,NAC预处理的HeLa细胞中绿色荧光斑点明显减少;Western Blot结果表明,NAC预处理的HeLa细胞中LC3-II的表达水平下调(p<0.01);流式细胞仪检测结果表明,与病毒对照组相比,NAC预处理的HeLa细胞凋亡率显著降低;Western Blot结果表明,NAC预处理的HeLa细胞中cleaved PARP和cleaved caspase-3的表达水平下调(p<0.05)。结论:UV-Tianjin诱导HeLa细胞发生自噬,其机制与PI3K/Akt/m TOR通路有关;UV-Tianjin诱导的HeLa细胞自噬与凋亡作用之间互相抑制;ROS在UV-Tianjin诱导的HeLa细胞自噬和凋亡中发挥重要作用,ROS既可促进HeLa细胞自噬,也可促进HeLa细胞凋亡作用。