【摘 要】
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盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotirium)的重寄生菌,是一种重要的生防菌。研究盾壳霉的分生孢子形成有利于促进该生防菌的规模化生产。本文以从盾
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盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotirium)的重寄生菌,是一种重要的生防菌。研究盾壳霉的分生孢子形成有利于促进该生防菌的规模化生产。本文以从盾壳霉ZS-1菌株T-DNA标记插入突变体库中筛选到的产孢缺陷型突变体ZS-1T16229菌株为材料克隆到产孢相关的基因,并对该基因进行功能验证,结果如下:突变体ZS-1T16229的菌丝偏向于培养基质中生长,菌丝生长速度与出发菌株ZS-1没有显著差别,但其生物学产量显著下降,寄生致腐菌核的能力下降了75%,丧失产生抗细菌物质的能力。在PDA培养基上,突变体ZS-1T16229菌株几乎不产孢,但与核盘菌对峙培养时,核盘菌能刺激其产孢,在PDA中添加核盘菌发酵液后,亦可促使其恢复部分产孢能力。实验室前期采用TAIL-PCR获得了突变体ZS-1T16229的T-DNA插入位点侧翼的基因组DNA片段,本研究采用RT-PCR技术对T-DNA标记插入位点的基因组DNA进行了进一步克隆,共获得了大小为2037 bp的DNA片段。利用GenScan软件进行了阅读框(ORF)预测:位于第435nt开始的ATG为起始密码子,该DNA片段含有一个完整的开放性阅读框架(核苷酸的位置在435-1961),编码508 aa。对推定的氨基酸序列进行功能预测,发现该序列中含有保守区域,即PEX2-PEX12域。该氨基酸序列与其他真菌的PEX2具有高度的同源性,如与烟曲霉(Aspergillus nidulans)Af293菌株的PEX2相同部位等同的氨基酸为53%,类似的氨基酸达68%;与产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的PEX2相同部位等同的氨基酸为52%,类似的氨基酸达64%;故命名该基因为CMPEX2。T-DNA标记插入该基因中间位置。RT-PCR结果表明CMPEX2基因在ZS-1T16229基因组中不表达,在菌株ZS-1的基因组中表达。构建了CMPEX2基因敲除载体和互补载体,利用农杆菌介导转化的方法分别转化ZS-1菌株和突变体ZS-1T16229菌株,获得了5个CMPEX2基因敲除转化子PD03、PD35、PD58、PD78、PD92和1个CMPEX2基因互补转化子PC01,5个CMPEX2基因敲除转化子与出发菌株ZS-1相比,产孢能力显著下降,表型与突变体ZS-1T16229一致;而互补转化子PC01产孢能力比突变体ZS-1T16229菌株显著提高,表型与ZS-1菌株一致。证实CMPEX2与盾壳霉的分生孢子形成相关。
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