论文部分内容阅读
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）感染引起的以卵巢炎及产蛋率下降为特征的传染性疾病。该病传播速度快、范围广、发病率高,自2010年爆发以来,给我国养鸭业造成了严重的经济损失。目前尚未有商品化疫苗预防该病,因此研发DTMUV疫苗迫在眉睫。本研究从种番鸭场发生产蛋率异常下降的鸭群中采集病料,接种11日龄番鸭胚,通过RT-PCR及间接免疫荧光技术鉴定,分离到一株番鸭源坦布苏病毒,并命名为ZJSBL01株。动物回归试验表明,番鸭感染DTMUV后出现采食量降低、产蛋率下降等症状,产蛋率最低降到20%以下,主要病理变化为卵泡充血出血及脾脏肿大,利用real-time PCR在脾脏检测到高病毒载量。全基因组测序发现ZJSBL01株基因组全长10990 nt,5’-非编码区（UTR）长94 nt,3’-UTR长618 nt,它们之间为一个开放性阅读框（ORF）,编码一个3425 aa的多聚蛋白。ZJSBL01株全基因组与国内水禽源TMUV核苷酸同源性在97.4%-99.5%之间,与1955年鉴定的TMUV MM1775株ORF核苷酸同源性为88.7%。通过MEGA软件对ZJSBL01与其他黄病毒属成员的ORF序列进行遗传进化分析,发现ZJSBL01与国内流行的禽源TMUV处于同一分支,且遗传关系非常近,并且与TMUV MM1775株及Sitiawan病毒在同一分支上,同属于恩塔亚（Ntaya）亚群。本研究通过RT-PCR扩增了E蛋白结构域III（EDIII）基因,克隆至原核表达载体pET-28a,转化到E.coli感受态细胞BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,获得了重组EDIII蛋白。利用EDIII作为包被抗原,建立了检测DTMUV IgG抗体的间接ELISA方法,并对反应条件进行优化。最终确定抗原包被浓度为4μg/mL、血清稀释度为1:40、抗原包被条件为37℃包被4 h、含3%BSA的PBST 37℃封闭2 h、酶标二抗1:1000稀释、底物反应时间为15min作为ELISA的最佳反应条件。当样品S/P大于0.306判定为阳性。将ZJSBL01株在DF-1细胞上连续传代,获得F50代次,然后将F50连续在DF-1细胞上传代并添加100μg/mL 5-氟尿嘧啶诱导突变,获得F50-20突变株。将亲本毒株、F50以及F50-20通过肌肉注射分别接种7日龄麻鸭。试验过程为发现发病情况,剖检发现攻毒后3 d亲本毒株组和F50组脾脏出现肿大,而F50-20组正常。攻毒后3d,亲本毒在脾脏、肺脏、法氏囊以及胸腺的病毒载量显著高于ZJSBL01 F50-20株的病毒载量,F50在脾脏、肺脏、肾脏、法氏囊、胸腺和脑的病毒载量显著高于ZJSBL01F50-20株的病毒载量。亲本毒株、F50-10及F50-20通过肌肉注射接种产蛋番鸭,亲本毒株鸭出现采食量降低、产蛋率下降、卵泡严重充血出血以及脾脏肿大等坦布苏病毒特征性症状和病理变化,F50-10出现轻微的产蛋率下降及轻微的卵泡充血,F50-20未出现产蛋率异常下降,仅出现轻微的脾脏肿大。ELISA检测结果表明,F50-20攻毒后7d坦布苏病毒抗体阳性率100%。免疫试验结果表明,F50-20能有效保护产蛋番鸭抵抗ZJSBL01亲本毒株的攻击,采食量、产蛋率正常,卵巢未出现异常病理变化。综上所述,ZJSBL01 F50-20已致弱,并保留良好的免疫原性,为坦布苏病毒疫苗的研发提供候选株。对F50-20全基因组进行测定,与亲本毒株相比,F50-20核苷酸突变位点28个,其中10个核苷酸突变导致10个氨基酸位点突变,分布在E、NS1、NS3和NS5,另外有18个核苷酸为无义突变或在非编码区上。这些突变可能与毒株致病性变化的相关。