论文部分内容阅读
本文通过对野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因进行分段克隆，对其N端和C端进行截短然后在大肠杆菌表达系统中表达，通过对表达酶学性质的研究来探讨其基因结构与功能之间的关系。
克隆到一个截去信号肽的产α-淀粉酶的重组质粒(pKSAMY2)并在大肠杆菌DH5α中表达，结果发现该不含信号肽的淀粉酶具有酶活。这说明不含信号肽的酶能够正确折叠并保持其空间结构，具有其催化中心和底物结合部位。试验中我们发现信号肽序列对于胞内的α-淀粉酶(KSXC2)活性没有任何影响。
为了研究C端非催化区对催化能力和特异性的影响，我们克隆了三个大小不同的截短的α-淀粉酶。重组表达载体pKSXC1、pKSXC3和pKSXC4分别转化入大肠杆菌DH5α中，重组菌株经0.5％可溶性淀粉诱导表达产物都具有酶活，经10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测后用凝胶成像分析软件分析其分子量分别为14kDa，25.7kDa,35.8kDa，与从截短淀粉酶核苷酸序列推算出来的氨基酸的分子量大小一致。分析截短酶活性质发现截短α-淀粉酶(KSXC1)的活性略高于出发α-淀粉酶的酶活，这说明截去保守区B，C，D区的酶活性中心没有改变，也不是表达量的变化使酶活提高。据推测可能失去保守区B，C，D的影响，酶活中心与底物结合的效率和特异性发生改变。两个截短酶(KSXC3和KSXC4)的最适温度与出发菌株酶(KSXC)相同。然而这三种酶的热稳定性却存在着比较大的差异。
生物信息学分析表明，该α-淀粉酶的具有四个保守区域，分别为保守区A，B，C，D区。其中保守区A是催化中心，主要负责催化淀粉水解，占有整个基因的一个很小的部分。通过试验结果和结构分析表明，C端的保守区B，C，D区不影响酶活性质，只是与淀粉酶的稳定性和特异性有关。