论文部分内容阅读
麦芽低聚糖是一种功能性糖源,由210个葡萄糖单元以α-1,4-糖苷键连接而成,具有良好的理化性质和特殊的生理功效,在食品及医药领域中有着越来越广泛的应用。麦芽低聚糖生成酶（Maltooligosaccharide-forming amylase,MFA酶）是工业制备麦芽低聚糖的主要酶制剂。目前已有多种不同来源的MFA酶实现了异源表达,但分泌量普遍较低,限制了该酶的工业应用。同时,对MFA酶结构与功能的研究尚且有限,因此,研究其催化机制及构效关系对酶的深入研究和分子改造具有重要意义。本课题以来源于Pseudomonas saccharophila STB07的MFA酶(MFAps酶)为研究对象,首先,分别构建了MFAps酶的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母表达系统,实现了酶的胞外过表达。研究发现,Bacillus subtilis WB600是表达MFAps酶的最佳体系,摇瓶培养72 h后发酵液酶活达144.60 U/mL,比文献报道水平提高了13.7倍,比酶活为980.49 U/mg;MFAps酶在Escherichia coli BL21（DE3）中表达,发酵72 h后发酵液酶活仅为6.49 U/mL;Pichia pastoris GS115培养72 h后分泌MFAps酶酶活可达225.23 U/mL,但纯化后发现比酶活被显著抑制,仅为220.21 U/mg。其次,选择在B.subtilis WB600中表达的MFAps酶,分析其酶学性质。结果表明,该酶的反应最适温度为5055oC,最适pH为6.5。酶在碱性环境中的热稳定性较好,50oC下,在pH 8.5的Gly-NaOH缓冲液保温2 h后仍能保持约88%残余酶活。此外,在pH 7.0的Tris-HCl缓冲液中添加5 mmol/L Ca2+也能使酶在50oC下保温2 h后保持80%以上活力。将MFAps酶作用于不同底物发现,酶对支链淀粉的亲和力和催化效率远高于直链淀粉,在麦芽糊精及几种不同原淀粉中,酶对蜡质玉米淀粉的亲和力和催化效率最高。水解模式研究结果表明,MFAps酶倾向于外切的作用机制。为研究MFAps酶的催化机制,结晶得到分辨率为1.5?的酶结构。其结构显示,该酶由A、B、C三个结构域组成,包含（β/α）8桶状结构与2个Ca2+结合位点。在此基础上得到分辨率分别为1.5?和1.1?的酶与底物（麦芽四糖或麦芽七糖类似物）复合结构MFAps/G4与MFAps/pG7。对活性中心-4+3亚位点的结构分析表明,非还原末端残基Gly158和Glu160及-3亚位点的疏水堆积作用对底物定位有重要作用;同时,非还原端亚位点数目及loop结构可能决定了酶的外切模式及G4产物特异性。利用HPAEC-PAD对MFAps酶的产物特异性进行验证,结果表明,酶几乎不水解（麦芽三糖）G3和G4,水解DP值>4的麦芽低聚糖主要生成G4。酶作用于直支链淀粉时主产物均为G4,特别地,酶作用于直支链淀粉时分别具有更高的转化率（72.27%）和更高的主产物比例（76.25%）。最后,初步探究了利用MFAps酶生产G4的反应条件。选取2%玉米淀粉为底物,在pH 8.5、50oC条件下,加入2 U/g干基淀粉的MFAps酶,反应48 h后底物转化率和G4比例分别为72.21%和76.75%。