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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)作为猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的病原,感染仔猪后,能够使仔猪出现呕吐、脱水、急性肠炎和水样腹泻等症状。PEDV入侵细胞主要由其纤突蛋白S蛋白介导,S蛋白兼具受体识别和膜融合的作用。PEDV在体外细胞系中增殖需要在培养基中添加胰蛋白酶,从而使得S蛋白充分发挥融合作用,最后达到病毒体外增殖的效果,研究S蛋白在PEDV侵染细胞中的作用机制,对进一步从病毒与受体互作层面阐述PEDV侵染细胞的作用机制,具有十分重要的意义。为了探究PEDV流行毒株SHpd/2012侵染细胞的特性,本研究采用IFA(间接免疫荧光)及绘制病毒一步生长曲线等方法,对感染PEDV SHpd/2012株后的Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)病变过程进行研究。结果发现,CPE(细胞病变)主要表现为细胞肿胀、变圆、皱缩、聚集成合胞体甚至从培养瓶壁大量脱落。IFA结果显示,接毒后12h病毒开始增殖,在接毒后36h时感染细胞数量最多,其后病毒增殖速度逐步下降,60h时趋于平稳。病毒一步生长曲线结果显示,SHpd/2012株感染细胞后24-60h的毒价一直处于较高水平,60h后开始下降。此外,本研究成功克隆并真核表达了PEDV S蛋白,为研究PEDV与受体蛋白的互作及病毒的致病机制奠定基础。截至目前,猪氨基肽酶(pAPN)是否为PEDV的受体一直争议较大,PEDV与pAPN的相互作用也尚不明确,为了研究PEDV流行毒株SHpd/2012的S蛋白与pAPN的相互作用,本研究首先完整表达了S蛋白和pAPN,并通过脂质体转染、Western、pull-down、IFA等方法,对二者的互作情况进行研究。结果发现,PEDV流行毒株SHpd/2012的S蛋白与pAPN蛋白相互作用的功能域为第249-529位氨基酸,且第249和第529位氨基酸为其关键氨基酸位点。相比于经典毒株CV777株的S基因序列,本研究所用毒株在第249和第529位氨基酸处均发生了碱基突变,其中第249位由甘氨酸G突变为异亮氨酸I,在第529由天冬氨酸D突变为异亮氨酸I。我们推测新流行毒株互作功能域两端的关键氨基酸(异亮氨酸)对于互作功能域的划分起主要作用。二者互作区域的确定为研究病毒的入侵机制积累数据。为了更直观的探究PEDV流行毒株SHpd/2012的S蛋白与pAPN蛋白的相互作用,本研究采用系统发育进化树分析,SWISS-MODEL预测三维结构等方法,对S基因的亲缘关系、S蛋白的三维结构及二者互作后的三维结构进行研究。结果发现,SHpd/2012株S蛋白与广东PEDV流行毒株同源性较高,S蛋白三维结构为有一个顶端支柱的三聚体结构,S蛋白与pAPN蛋白相互作用后的三维结构是一个大的复杂二聚体结构。