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猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）属于细小病毒科细小病毒属，是无囊膜的DNA病毒。PPV病毒感染能够引起母猪繁殖障碍性疾病，造成母猪流产、胎儿畸形、木乃伊化及死亡等，给我国养猪业的发展造成巨大危害。PPV在大多数猪原代细胞和传代细胞上均能增殖，并使细胞发生明显病变，常作为模式病毒来探究病毒的感染机制和药物的抗病毒机制。核转录因子-κB（nuclear transcription factor kappaB，NF-κB）是细胞内重要的核转录因子，能够调控多种炎性细胞因子、趋化因子等的转录，Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）能够通过MyD88(Myeloid differentiation factor88)依赖途径和MyD88非依赖途径诱导NF-κB和TRAF6（TNF receptor associated factor-6）等基因活化，引起相关炎性细胞因子、趋化因子及干扰素等的合成与释放，并在免疫应答反应中发挥重要作用。本研究用猪肾传代细胞（PK-15）作为细胞模型，首先研究了PPV感染细胞后TLR1-10的表达情况，然后研究了PPV感染PK-15细胞对NF-κB信号通路和免疫应答的影响，最后对TLR9在PPV感染细胞激活NF-κB信号通路中的功能进行研究，明确了TLRs在PPV感染PK-15细胞后诱导的天然免疫反应中的作用。研究内容如下： 1.根据GenBank中猪TLR1~10基因序列设计荧光定量PCR特异性引物，并检测PPV感染PK-15细胞后TLR1~10的转录规律。结果显示，PPV感染PK-15细胞后，TLR1在PPV感染后3h表达上调，约为对照细胞的3.1倍，其他时段均低于正常水平；TLR3和TLR7mRNA表达水平在病毒感染早期均低于正常水平；TLR4和TLR8的mRNA均在感染后3、12和36h表达上调，TLR10分别在在3h和36h表达上调，其他时段均不同程度的降低；而TLR2和TLR9mRNA表达水平在感染后24h开始升高，并于48h达到峰值，分别为空白水平的10.1倍和26.7倍。表明PPV感染PK-15细胞后能够诱导细胞上TLR2和TLR9在mRNA水平显著上调。 2.为研究PPV感染PK-15对NF-κB信号通路和免疫应答的影响，通过荧光定量PCR方法检测PPV感染PK-15细胞后MyD88、TRAF6和NF-κB等通路相关因子及炎性细胞因子IL-6在mRNA水平的表达情况，同时利用ELISA方法检测PPV感染后炎性细胞因子IL-6的变化规律。结果显示，PPV感染PK-15细胞后通路相关因子MyD88、IRAK1、TRAF6、TAK1α、IκBKB和NF-κB在感染后期表达量显著升高；IL-6的mRNA和蛋白表达均在感染后36h达到峰值。以上结果表明PPV感染PK-15细胞后激活了NF-κB信号通路，并引起炎性因子的表达。 3.为进一步研究TLR9在TLRs-NF-κB信号通路介导的天然免疫反应中的作用，本研究利用TLR9抑制剂E6446二盐酸盐来研究TLR9在PPV感染PK-15细胞激活NF-κB信号通路中的作用。结果显示0.02μM和0.03μM E6446二盐酸盐能够特异性抑制TLR9的表达，并引起IL-6的表达量下调；对不同时间段细胞分泌IL-6浓度研究显示，E6446二盐酸盐处理的细胞IL-6的表达量在48h达到峰值，而PPV感染组细胞内IL-6的分泌在24h达到峰值。 本研究发现PPV感染PK-15细胞后能够被TLR9识别，通过MyD88依赖途径激活NF-κB，并调控炎性细胞因子IL-6的表达。