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喜树碱(Camptothecin，CAM)是目前临床使用的CAM类药物拓扑替康、伊立替康的化学半合成原料，主要来源于中国特有药用植物——喜树(Camptotheca acuminata)。植物来源的CAM满足不了CAM类药物的市场需求，需要发展新的技术以获得CAM。利用生物技术挖掘参与CAM生物合成途径的基因，并进行功能表征，通过代谢工程、生物合成调控、合成生物学等合成、提高CAM产量是获得CAM的一种有效手段。因此，对CAM生物合成过程中参与单萜单元生物合成的香叶基焦磷酸合酶(CaGPPS)、香叶醇-10-羟化酶(CaG10H)进行了研究，并通过合成生物学手段将它们应用于香叶醇和10-羟基香叶醇的异源生产。 香叶基焦磷酸(GPP)是所有单萜及其衍生物的生物合成前体。GPP是由异戊烯基焦磷酸(IPP)和它的同分异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)在同质或者杂合GPPS的催化作用下头尾缩合而成。GPP在香叶醇合酶(GES)的催化下水解脱去焦磷酸基团形成香叶醇。香叶醇具有抗菌、抗氧化、抗炎等多种生物活性;在香料生产方面具有重要的商业价值;具有低吸湿力、高能量、相对较低的挥发性，被考虑作为燃油的补充/代替品。对喜树进行无菌苗培养，提取无菌苗总RNA，以其为模板进行反转录获得5-RACE cDNA和3-RACE cDNA。然后通过5-RACE和3-RACE分别获得了CaGPPS的5-和3-末端，再通过重叠PCR(OE-PCR)技术，以5-和3-末端为模版，获得CaGPPS全长。将pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO，ispA)中的ispA替换为截短的CaGPPS(tCaGPPS)，同时构建了pETDuet-tCaGPPS(MCS1)-tCaGES(MCS2)，将上述质粒共同转入Escherichia coli BL21(DE3)进行体内功能表征。通过培养、发酵、HPLC-DAD分析、定量上述菌种的发酵产物，香叶醇的产量为24.0±1.3mg L-1，说明该CaGPPS是具有催化IPP和DMAPP形成GPP的功能。为了进一步提高香叶醇的产量，首先将不同拷贝数的tCaGPPS、tCaGES引入E.coli中进行表达，以平衡GPPS和GES的催化能力。当tCaGPPS和tCaGES的拷贝数为4∶1时，香叶醇的产量提高到1.6倍。其后，对添加IPTG的时间、诱导后发酵转速、发酵时间、额外添加葡萄糖、添加葡萄糖的同时移除有机相并新加入有机相等发酵条件进行优化，在最优发酵条件下，香叶醇的产量在摇瓶水平可达74.6±6.5mg L-1。研究结果表明，tCaGPPS和tCaGES的拷贝数比例在E.coli工程菌产香叶醇中起着重要作用;香叶醇是一种非环状单萜烯醇，其在发酵液或者正癸烷中的溶解度是有限的，所以移除发酵体系中的有机相并添加新的有机相对于在E.coli工程菌中持续的生产香叶醇有很大帮助。 10-羟基香叶醇是香叶醇的10-位甲基(CH3-10)在香叶醇-10-羟化酶(G10H)的催化下羟化而得到，该氧化反应需要细胞色素P450还原酶(CPR)的参与。G10H是萜类吲哚生物碱(TIAs)中萜类单元生物合成途径中关键的限速酶之一。将已分子克隆得到的喜树G10H(CaG10H)构建到含有喜树CPR(CamCPR)的表达载体中得到pETDuet-CaG10H(MCS1)-tCamCPR(MCS2)，将上述表达载体转入E.coli中，进行CaG10H和tCamCPR的异源共表达。通过培养、裂解菌体，得到裂解液，将裂解液上清用于香叶醇的C-10位羟化反应测试。HPLC-DAD和HRMS分析表明CaG10H具有催化香叶醇为10-羟基香叶醇的功能。为了能通过合成生物学的方法生产10-羟基香叶醇，将喜树碱生物合成上游途径中相邻的三个基因GPPS、GES、G10H构建到适合的表达载体中，进行共转培养发酵，从而进行10-羟基香叶醇的异源生产。首先，通过文献调研，选取能高效专一的生产GPP的AgGPPS2(AAN01134.1)进行了密码子优化、全基因合成，用其代替催化效率相对较低的CaGPPS;将pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO，ispA)中的ispA替换为AgGPPS2，同时构建了pRSFDuet-AgGPPS2(MCS1)-tCaGES(MCS2)、pETDuet-CaG10H(MCS1)-tCaCPR(MCS2)，将上述质粒共同转入E.coli。通过培养、发酵、HPLC-DAD分析、定量上述菌种的发酵产物。