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尖头大吻鱥(Rhynchocypris oxycephalus)属于冷水性小型鱼类，广泛分布在我国的山涧溪流中，由于长期适应于在冷水中生活，因而对水温升高十分敏感。随着全球气候变暖加剧，冷水性鱼类的生存环境不断减少，通过对冷水鱼高温胁迫效应和适应机制的研究，可以为尖头大吻鱥的保护提供理论依据。本文通过前期设置多温度梯度的预实验，同时对11℃以及高温处理12h的16℃、26℃的尖头大吻鱥脾脏组织进行高通量测序，分析尖头大吻鱥不同温度下转录组和miRNA的变化，以探讨在高温情况下尖头大吻鱥在高温状况下的基因表达情况和miRNA的表达情况，初步探讨miRNA对靶基因表达调控的影响。主要研究结果如下：
1．通过对尖头大吻鱥转录组测序，经过生物信息学分析后，共得到转录本序列214308325条，其中包含Unigenes数量为130635206条。通过差异基因筛选发现，共有差异表达基因1316个，其中上调基因334个，下调基因982个。通过GO分析发现，富集最多的是生化途径，其次分别是是分子功能和细胞组分中注释的基因数。通过KEGG分析，对照组11℃和21℃对比以及21℃和26℃对比，发现金黄色葡萄球菌感染通路(Staphylococcus aureus infection )、近端小管重碳酸盐回收(Proximal tubule bicarbonate reclamation)、军团菌病(Legionellosis)等信号通路差异表达基因富集显著性最高，这些信号通路中主要的基因为补体以及热休克蛋白，推测认为温度升高导致体内器官损伤，补体含量上升，同时热休克蛋白对受热损伤的细胞具有修复作用，增加了鱼体的免疫力。另外还有一些相关的信号通路均和免疫和代谢相关。
2．miRNA通过高通量测序，筛选一定长度范围内的sRNA进行后续分析，共得到Mappendmature(比对上的miRNA成熟体)总数为146个，Mappedhairpin(比对上的miRNA前体)总数为178个。对于新miRNA预测，共得到Mappendmature(比对上的miRNA成熟体)总数为177个，Mappedstar(预测到的miRNA*链)92个。其中，21℃和11℃对照组对比，存在18个上调的miRNA，23个下调的miRNA；26℃和11℃对照组对比，存在11个上调的miRNA，30个下调的miRNA；21℃和26℃对比，存在15和上调的miRNA，1个下调的miRNA。对照组11℃和21℃对比以及对照组11℃和26℃对比，预测到差异miRNA的靶基因相关信号通路中细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)信号通路涉及的基因最多；21℃和26℃对比，预测到差异miRNA的靶基因相关信号通路中甘油磷脂代谢(Glycerophospholipid metabolism)信号通路涉及的基因数最多。这些代谢通路虽然和转录组结果未完全重叠，但同样是富集在免疫以及代谢相关的代谢通路，推测认为由于高温导致尖头大吻鱥机体损伤诱导了这些代谢通路的相关miRNA富集。
3．通过荧光定量验证，验证了主要涉及内质网蛋白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)通路(HSP70、HSP90β1、HSP90β2)以及金黄色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureus infection)通路(C3、MHCⅡB)的基因，挑选有注释结果且表达量发生显著变化的NF-κB2、RH、MT1基因，并且随机选择了根据计算结果不同表达趋势的10个的miRNA，结果显示表达趋势和转录组测序分析结果一致，进一步肯定了转录组和miRNA分析的可靠性。
4．为进一步验证基因及其调控相关的miRNA之间的调控关系，我们设计另一组实验，验证miRNA和基因之间相互的调控作用。设置了16℃、21℃、26℃三个温度梯度，在不同时间段验证HSP70和miR-101a之间的相互作用。温度升高导致miR-101a的表达量下降，但随着温度的升高，肝脏内的HSP70快速增加，在24h时表达量达到最高，此时，miR-101a的表达量也出现回升，随后HSP70表达量逐渐下降，miR-101a的表达量也随着减少，该结果和已报道的研究结果一致，验证了高温胁迫下miRNA和靶基因之间的相互作用。
总结：本论文通过转录组及相关miRNA测序，分析了不同温度下尖头大吻鱥的差异表达基因和差异表达miRNA，其中有1650个基因和323个miRNA参与了这一调控适应过程，并通过选择一定数量的基因和miRNA通过荧光定量验证了测序以及数据分析结果的准确性，后续进一步实验验证miRNA和靶基因的调控关系。转录组的差异表达基因和miRNA的靶基因均富集在代谢以及免疫相关的KEGG通路。通过本论文我们建立了高温胁迫下尖头大吻鱥的转录组表达谱和miRNA数据库，为后续多组学研究全面揭示高温胁迫下冷水鱼类代谢通路变化等高温适应机制奠定基础。
1．通过对尖头大吻鱥转录组测序，经过生物信息学分析后，共得到转录本序列214308325条，其中包含Unigenes数量为130635206条。通过差异基因筛选发现，共有差异表达基因1316个，其中上调基因334个，下调基因982个。通过GO分析发现，富集最多的是生化途径，其次分别是是分子功能和细胞组分中注释的基因数。通过KEGG分析，对照组11℃和21℃对比以及21℃和26℃对比，发现金黄色葡萄球菌感染通路(Staphylococcus aureus infection )、近端小管重碳酸盐回收(Proximal tubule bicarbonate reclamation)、军团菌病(Legionellosis)等信号通路差异表达基因富集显著性最高，这些信号通路中主要的基因为补体以及热休克蛋白，推测认为温度升高导致体内器官损伤，补体含量上升，同时热休克蛋白对受热损伤的细胞具有修复作用，增加了鱼体的免疫力。另外还有一些相关的信号通路均和免疫和代谢相关。
2．miRNA通过高通量测序，筛选一定长度范围内的sRNA进行后续分析，共得到Mappendmature(比对上的miRNA成熟体)总数为146个，Mappedhairpin(比对上的miRNA前体)总数为178个。对于新miRNA预测，共得到Mappendmature(比对上的miRNA成熟体)总数为177个，Mappedstar(预测到的miRNA*链)92个。其中，21℃和11℃对照组对比，存在18个上调的miRNA，23个下调的miRNA；26℃和11℃对照组对比，存在11个上调的miRNA，30个下调的miRNA；21℃和26℃对比，存在15和上调的miRNA，1个下调的miRNA。对照组11℃和21℃对比以及对照组11℃和26℃对比，预测到差异miRNA的靶基因相关信号通路中细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)信号通路涉及的基因最多；21℃和26℃对比，预测到差异miRNA的靶基因相关信号通路中甘油磷脂代谢(Glycerophospholipid metabolism)信号通路涉及的基因数最多。这些代谢通路虽然和转录组结果未完全重叠，但同样是富集在免疫以及代谢相关的代谢通路，推测认为由于高温导致尖头大吻鱥机体损伤诱导了这些代谢通路的相关miRNA富集。
3．通过荧光定量验证，验证了主要涉及内质网蛋白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)通路(HSP70、HSP90β1、HSP90β2)以及金黄色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureus infection)通路(C3、MHCⅡB)的基因，挑选有注释结果且表达量发生显著变化的NF-κB2、RH、MT1基因，并且随机选择了根据计算结果不同表达趋势的10个的miRNA，结果显示表达趋势和转录组测序分析结果一致，进一步肯定了转录组和miRNA分析的可靠性。
4．为进一步验证基因及其调控相关的miRNA之间的调控关系，我们设计另一组实验，验证miRNA和基因之间相互的调控作用。设置了16℃、21℃、26℃三个温度梯度，在不同时间段验证HSP70和miR-101a之间的相互作用。温度升高导致miR-101a的表达量下降，但随着温度的升高，肝脏内的HSP70快速增加，在24h时表达量达到最高，此时，miR-101a的表达量也出现回升，随后HSP70表达量逐渐下降，miR-101a的表达量也随着减少，该结果和已报道的研究结果一致，验证了高温胁迫下miRNA和靶基因之间的相互作用。
总结：本论文通过转录组及相关miRNA测序，分析了不同温度下尖头大吻鱥的差异表达基因和差异表达miRNA，其中有1650个基因和323个miRNA参与了这一调控适应过程，并通过选择一定数量的基因和miRNA通过荧光定量验证了测序以及数据分析结果的准确性，后续进一步实验验证miRNA和靶基因的调控关系。转录组的差异表达基因和miRNA的靶基因均富集在代谢以及免疫相关的KEGG通路。通过本论文我们建立了高温胁迫下尖头大吻鱥的转录组表达谱和miRNA数据库，为后续多组学研究全面揭示高温胁迫下冷水鱼类代谢通路变化等高温适应机制奠定基础。