枣内生细菌种群多样性和内生拮抗细菌筛选的研究

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本研究以河北省不同枣品种为研究对象,采用微生物传统分离培养的方法、分子生物学技术、生理生化测定方法研究了枣内生细菌的遗传多样性、分布状态多样性及其动态分析,首次系统地对婆枣内生细菌的多样性及种群结构分布状态进行了研究,对婆枣缩果病(亦称枣铁皮病)病健株的内生细菌进行了比较,并分离筛选出对缩果病原菌及植物常见病原菌有拮抗作用的内生细菌。主要获得以下研究成果:1.对枣树的根、枝条、叶片和果实表面最佳灭菌条件进行了研究,确定出最佳灭菌条件:先用75%乙醇浸泡3min,然后叶片用3.0%次氯酸钠溶液处理3min,枝条用2.5%次氯酸钠溶液处理4min,根用2.5%次氯酸钠溶液处理4min,果实则用2.5%次氯酸钠溶液处理3min,再用75%乙醇浸泡30s,最后用无菌水冲洗。通过对10种培养基的筛选,确定出了适宜的培养基,即采用TSA培养基、KMB和NA培养基组合进行培养,分离出内生细菌的种群数量和菌落种类较多。2.对河北省5地区的不同枣品种及其不同组织器官的内生细菌的种类和数量进行分离分析,结果表明在枣的不同器官组织中均能分离到内生细菌,在不同地区、不同枣树品种以及植株的不同器官组织中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和假单胞杆菌属(Pseudomonas sp.)均有分布,且二者为优势种群;从组织中分离出的内生细菌种类和数量因地区、品种、器官、生育期不同而异。不同器官内生细菌的种类基本遵循根部最多,其次是叶片和果实,枝条最少的规律;内生细菌的数量则为根部最多,其次为叶片和枝条,果实中最少。共分离出内生细菌13个属,16个种,分别为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)等属,其中首次从枣植株内分离到湿斯捷连科属Nesterenkonia、寡养单胞菌属Stenotrophomonas、土地杆菌Pedobacter,Gamma proteobacterium等10个属。3.本试验对婆枣内生细菌进行了较为系统的研究,结果表明,婆枣植株内有大量种群丰富的内生细菌,根部和枝条内生细菌种群数量和密度均高于叶片组织。分离出的212株内生细菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)和葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)等11个已知属,其中优势菌种类为芽孢杆菌属,优势种群在枣组织内均有分布,但在根部、枝条和叶片中所占比例不同。物候期不同,植株体内内生细菌数量和种类有所不同,从休眠期到盛花期,内生细菌数量、种类逐渐增多,从盛花期、幼果期到果实生长中后期,内生细菌的数量和种类逐渐减少,它们之间的差异达到了极显著水平;不同器官内生细菌的分离几率也不相同,从高到低的次序为根、枝条、叶片、果实,根部分离出的菌落种类最多,高达15种。4.对婆枣缩果病株和健株内生细菌的分离结果表明,病株叶片和枝条中所分离的内生菌种类少于健株,而内生菌数量则大于健株;病株果实内所分离的内生细菌种类和数量均小于健株。缩果病发病率、病情指数与芽孢杆菌属细菌的含量之间呈负相关。内生细菌在不同的组织器官之间存在显著差异,而叶片与果实、枝条与果实、叶片与枝条之间关系不显著;上、中、下不同位置叶片、枝条、果实之间的内生细菌差异不显著,而东、西、南、北不同方位叶片、枝条之间的内生细菌含量差异显著。分析多样性指数表明SHANNON(H1)指数枝条最高,果实最低,SIMPSON(D)指数最大值出现在枝条,果实最低,Pielou(E)指数叶片最高,枝条最低。5.对从婆枣中分离的19个菌株做了体外抗菌试验,筛选出对供试菌有体外抗菌活性的菌株7株,占菌株总数的36.8%,其中PZ-4、PZ-5、PZ-7、PZ-12等4株对8株供试菌株均有拮抗作用,并对引起枣缩果病的细交链孢菌(Alternaria. Alternata)和茎点霉菌(Allantophomoides carotae)表现出较强抑菌活性,经鉴定分别为芽孢杆菌属Bacillus sp.、节杆菌属Arthrobacter、假单胞杆菌属Pseudomonas、湿斯捷连科属Nesterenkonia。6.通过对PZ-4菌株形态学、生理生化指标及其分子特性的研究,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株对枣缩果病病原菌(细交链孢菌Alternaria.alternata和茎点霉菌Allantophomoides carotae),禾谷镰刀菌(Fusarium grami-nearum)、玉米大斑菌(Bipolaris maydis),苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternate f.sp.mali),苹果腐烂病菌(Cytospora sp.),番茄灰霉菌(Botrytis cinerea),苹果轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana f. sp. piricola)等8种病原真菌均有抑制作用,抑菌率在41.2%-69.3%,抑菌圈明显,说明该菌抑菌普较广。
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