论文部分内容阅读
本研究第一部分采用响应面法优化α-糖苷酶水解淀粉的最佳条件，旨在构建一个体外酶学体系来模拟人肠道内淀粉的降解过程，为α-糖苷酶抑制剂类药物的研发提供新的工具。直链淀粉在人小肠内先经α-淀粉酶水解为糊精和较短的麦芽低聚糖，低聚糖再经小肠麦芽糖苷酶水解为单个的葡萄糖，葡萄糖被吸收入血形成血糖。人胰腺α-淀粉酶(HPA)具有对α-1，4糖苷键的内切功能，麦芽糖苷酶的N端催化亚基(Nt-MGAM)和C端催化亚基(Ct-MGAM)都具α-1，4外切功能，但在底物底物特异性上有所不同。本研究旨在考察重组HPA、Nt-MGAM和Ct-MGAM在降解淀粉时的组合作用。首先应用Plackett-Burman实验筛选淀粉水解为葡萄糖这一生化过程中的主要因素，结果发现:在底物（淀粉）量、HPA浓度、Ct-MGAM浓度、Nt-MGAM浓度、反应pH值和反应温度6个考察因素中，pH和温度是主要的影响因素，而Nt-MGAM加入量对于葡萄糖的生成无显著性影响;然后采用中心组合实验(CCD)优化淀粉水解过程中HPA和Ct-MGAM的最佳配比，其最佳酶活力(U)比为1∶9，此时的淀粉降解度为88.05％;最后评估不同α-糖苷酶抑制剂对酶组合的抑制作用，通过比较各种抑制剂的半数抑制浓度（IC50值），发现阿卡他定AⅡ-03/AⅢ-03/AⅣ-03对酶组合的抑制效果最好，其抑制作用为市售药物阿卡波糖的67倍，是一类能够有效抑制淀粉水解过程的α-糖苷酶抑制剂。
本研究第二部分，从芽孢杆菌的发酵液中分离到一种具有大豆异黄酮水解活性的β-葡萄糖苷酶，命名为FbgA。研究表明:FbgA具有很好的热稳定性和pH稳定性，能在其最适温度下保温90 h和在pH5-8的范围内保温160 h后仍然保有90％以上的酶活性。另外，10 mM的Fe2+和Al3+能分别对FbgA产生80％和74％的抑制作用，但是葡萄糖对FbgA的抑制作用不强，其抑制常数（Ki值）为0.131 M。底物特异性分析表明FbgA能够专一水解带有芳香基团的β-葡萄糖苷，对oNPG的水解活性最高(Km=0.73 mM)，其次是pNP-木糖苷和pNPG，Km分别为1.84和2.71 mM，对β键连接的二糖无水解活性。同时，FbgA具有很高的大豆异黄酮水解活性。大豆异黄酮作为植物雌激素在抗肿瘤、抗氧化、防治骨质疏松症等方面具有很好的疗效，但它们不易被机体直接吸收，需经β-葡萄糖苷酶水解后以其苷元的形式吸收，发挥生物活性。在本研究中，0.002 U的FbgA在30 min内即可完全水解20μg的大豆苷和染料木苷生成大豆苷元和染料木素，说明FbgA是一个很具有应用前景的β-葡萄糖苷酶。