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目的:溃疡性结肠炎是由于免疫异常导致的肠道炎症性疾病,毛蕊异黄酮具有调节免疫、抗炎等生物学活性。本研究针对毛蕊异黄酮对溃疡性结肠炎小鼠的作用进行研究,探讨毛蕊异黄酮对溃疡性结肠炎治疗作用及其潜在的作用机制。方法:在体外细胞实验中,溶血率检测方法检测20μM、40μM、80μM、160μM和320μM等不同浓度的毛蕊异黄酮对小鼠红细胞的溶血作用,细胞增殖实验方法检测不同浓度的毛蕊异黄酮对小鼠巨噬细胞株Raw264.7细胞增殖的影响作用,根据溶血实验结果和细胞增殖实验结果确定体外细胞实验中应用毛蕊异黄酮的剂量。实时定量PCR检测毛蕊异黄酮影响脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞株细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA表达程度。酶联免疫吸附方法检测毛蕊异黄酮影响脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞株细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的含量。流式细胞术检测毛蕊异黄酮对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞株细胞中活性氧(ROS)的影响作用。免疫印迹方法检测毛蕊异黄酮对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞株细胞中NF-kB通路和MAPK通路的影响作用。建立葡聚糖硫酸钠(DSS)和三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的两种溃疡性结肠炎实验动物模型。Balb/c品系雄性小鼠共35只,按体重随机分为5组,每组7只,分别为正常对照组、0.5%羧甲基纤维素钠溶剂对照组、25mg/kg毛蕊异黄酮组、50mg/kg毛蕊异黄酮组、50mg/kg 5-氨基水杨酸药物对照组。葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎实验动物模型,小鼠连续给予含2.5%DSS的饮用水7天后,继续给予正常饮用水3天,建立溃疡性结肠炎实验动物模型,从造模第一天起,每天正常对照组给予连续10天正常饮用水并且应用0.5%羧甲基纤维素钠灌胃,模型溶剂对照组给予DSS以及0.5%羧甲基纤维素钠灌胃,治疗组分别为给予DSS以及25mg/kg毛蕊异黄酮或者50mg/kg毛蕊异黄酮灌胃,药物对照组给予DSS以及50mg/kg5-氨基水杨酸灌胃。三硝基苯磺酸诱导的溃疡性结肠炎实验动物模型,经小鼠肛门导管注射100μl的2.5%TNBS及50%乙醇溶液,建立溃疡性结肠炎实验动物模型,造模第一天,正常对照组给予无TNBS的100μl 50%乙醇溶液以及0.5%羧甲基纤维素钠灌胃,模型组给与TNBS以及0.5%羧甲基纤维素钠灌胃,治疗组分别为给予TNBS以及25mg/kg毛蕊异黄酮或者50mg/kg毛蕊异黄酮灌胃,药物对照组给予TNBS以及50mg/kg5-氨基水杨酸灌胃。自建立溃疡性结肠炎实验动物模型起,每日连续观察及记录小鼠生存状况、测量体重以及疾病活动指数,直至造模结束。造模结束后处死各组实验动物,取实验小鼠大肠组织,观察大肠组织病变状况,测量及记录大肠长度。实验小鼠大肠组织切片经苏木精-伊红染色评价病理改变状况。提取实验小鼠大肠组织总RNA,实时定量PCR检测炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA表达程度,酶联免疫吸附方法检测实验小鼠大肠组织中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量。超氧化物歧化酶和丙二醛试剂盒检测实验小鼠大肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量。免疫印迹法检测实验小鼠大肠组织中NF-kB通路中IKKα、IKKb、IkBα和p65总蛋白水平及其磷酸化水平,免疫印迹法检测实验小鼠大肠组织中MAPK通路中JNK、p38和Erk1/2总蛋白水平及其磷酸化水平。选取轻度及中度溃疡性结肠炎患者,治疗组给予静脉滴注黄芪注射液及口服美沙拉嗪肠溶片治疗,对照组给予口服美沙拉嗪肠溶片治疗。记录患者病情变化,根据疗效评判标准评价治疗效果,检测患者的血红蛋白(HB)浓度、白蛋白(ALB)浓度、C反应蛋白(CRP)浓度、红细胞沉降速率(ESR)、IL-6、TNF-α、SOD和MDA等各项血液指标,观察黄芪注射液在临床治疗中对溃疡性结肠炎患者的治疗作用。结果:在体外细胞实验中,小鼠红细胞溶血实验显示160μM和320μM毛蕊异黄酮对小鼠红细胞有较强的溶血作用,160μM和320μM毛蕊异黄酮处理小鼠巨噬细胞株细胞可抑制细胞增殖,综合毛蕊异黄酮对小鼠红细胞的溶血率检测结果和对小鼠巨噬细胞株细胞抑制率检测结果,选择应用20μM、40μM和80μM毛蕊异黄酮用于研究毛蕊异黄酮体外抗炎作用及其机制。40μM和80μM毛蕊异黄酮处理小鼠巨噬细胞株细胞可抑制脂多糖诱导的炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA表达水平,并且抑制IL-6和TNF-α炎症因子的生成。40μM和80μM毛蕊异黄酮处理小鼠巨噬细胞株细胞可抑制脂多糖诱导的ROS产生。40μM和80μM毛蕊异黄酮可抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞株细胞NF-kB通路中IKKα、IKKb、IkBα和p65蛋白磷酸化,阻滞IkBα磷酸化蛋白降解,可抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞株细胞中JNK蛋白磷酸,对p38和Erk1/2磷酸化水平无影响。在DSS和TNBS诱导的小鼠溃疡性结肠炎实验动物模型中,50mg/kg毛蕊异黄酮和对照药物5-氨基水杨酸可抑制DSS或TNBS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重下降、大肠长度减少、疾病活动指数升高。苏木精-伊红染色结果显示毛蕊异黄酮可以保护溃疡性结肠炎小鼠大肠黏膜组织内杯状细胞及隐窝形态完整、降低黏膜损伤、减少炎症细胞浸润。实时定量PCR和酶联免疫吸附实验结果显示,50mg/kg毛蕊异黄酮和对照药物5-氨基水杨酸可抑制DSS或TNBS诱导的溃疡性结肠炎小鼠大肠组织中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA表达水平,并且抑制IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1炎症因子的生成。50mg/kg毛蕊异黄酮和对照药物5-氨基水杨酸可抑制DSS或TNBS诱导的SOD活性的下降及MDA的生成。免疫印迹结果显示,50mg/kg毛蕊异黄酮或对照药物5-氨基水杨酸可以抑制DSS或者TNBS诱导的NF-kB通路中IKKα、IKKb、IkBα和p65磷酸化水平,可以抑制MAPK通路中JNK蛋白磷酸化,对p38和Erk1/2磷酸化水平无影响。临床研究结果表明黄芪注射液对溃疡性结肠炎患者具有明确的治疗作用,经联合应用美沙拉嗪肠溶片,治疗组的治疗有效率高于对照组,复发率低于对照组。患者经治疗后,HB、ALB和SOD指标的浓度增高,CRP、ESR、IL-6、TNF-α和MDA指标的浓度降低,对照组与治疗组相比HB指标的浓度变化无显著性差异,治疗组其余的检测指标变化程度均大于对照组相应的检测指标变化程度。结论:1.在体外细胞实验中,毛蕊异黄酮可以抑制脂多糖诱导的巨噬细胞中炎症因子mRNA表达以及炎症因子的产生,可以降低脂多糖诱导的ROS产生,其作用机制可能与阻断NF-kB和JNK通路有关。2.在实验动物模型实验中,毛蕊异黄酮可以抑制DSS或TNBS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的疾病状况,可以抑制大肠组织中mRNA表达以及炎症因子的产生,可以调节大肠组织中氧化应激反应,其作用机制可能与阻断NF-kB和JNK通路有关。3.黄芪注射液联合美沙拉嗪肠溶片对溃疡性结肠炎具有明确的治疗作用,黄芪注射液具有较好的临床应用意义。