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芡实(Euryale ferox Salisb)是睡莲科芡属一年生大型水生草本植物,原产东亚。芡实种仁含有丰富的营养物质和多种活性成分,其中淀粉占芡实种仁干物重的70%以上,是芡实种仁的主要储藏物质,其组成、颗粒结构对芡实食用品质起着决定性作用。目前,国内外关于芡实淀粉形成的研究很少,有关芡实种仁发育过程中淀粉形成的分子机制尚未见报道。论文以芡实’紫花苏芡’和’紫花刺芡’品种为试材,研究芡实种仁发育过程中淀粉含量变化及淀粉粒发育过程;利用蛋白质组技术,挖掘芡实种仁发育过程中与淀粉合成相关的重要蛋白,并克隆相关基因,以期为探明芡实种仁发育过程中淀粉形成的分子机制提供参考。1、芡实种仁发育过程中淀粉含量和淀粉粒形态研究:芡实种仁在花后10 d至20 d淀粉快速积累,增加幅度达到30%以上,花后30 d至40 d积累速度降低,增幅约为15%。种仁发育过程中,’紫花刺芡’直链淀粉含量始终高于’紫花苏芡’,但’紫花苏芡’种仁的总淀粉含量、支链淀粉含量及支链淀粉与直链淀粉含量的比值均高于’紫花刺芡’。’紫花苏芡’淀粉粒呈多面体,棱角分明,’紫花刺芡’淀粉粒棱角少而钝,部分偏圆,且’紫花苏芡’细胞中淀粉体排列更为紧密,充实度高。2、芡实种仁发育过程的蛋白质组分析:以拟南芥基因组为参考,利用iTRAQ技术在芡实种仁发育的4个阶段中共鉴定到969个差异蛋白,主要参与了碳水化合物代谢、生物合成与降解、蛋白的折叠与合成、转录翻译、核苷酸代谢等过程;鉴定到与淀粉和蔗糖代谢相关蛋白20个,其中与淀粉合成紧密相关蛋白4个,分别是SBE2.2(Starch branching enzyme 2.2)、APL2(ADP-glucosepyrophosphorylase large subunit 2)、APS 1(ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit 1)和 SS2(Starch synthase2)。SBE 在淀粉分支形成过程中起到重要的作用,进一步分析发现,SBE在芡实种仁的发育过程中呈现下调趋势,花后20 d、30 d和40 d的表达量仅为花后10 d表达量的68%、16%和15%。3、EfSBE1的克隆:利用PCR技术,从’紫花苏芡’克隆到芡实SBE cDNA序列,全长为2 796 bp;在NCBI数据库进行bastx比对,发现和其它作物的SBE同源性达76%以上,将该基因命名为EfSBE1。EfSBE1包括2 466 bp的开放阅读框,编码821个氨基酸残基,编码蛋白的分子量为94.3 kDa。比对后发现该序列与莲藕SBEⅠ的同源性达到78%,因此EfSBE1可能属于SBEⅠ型。利用上述材料,克隆得到EfSBE1基因组DNA序列全长为11 106 bp,由13个外显子和12个内含子构成。4、EfSBE1的表达分析:芡实种仁的发育过程中,EfSBE1在’紫花刺芡’和’紫花苏芡’花后10 d、15 d、20 d、25 d、30 d、35 d和40 d的表达存在显著差异,总体呈下调趋势。’紫花刺芡’和’紫花苏芡’花后40 d时EfSBE1表达量仅为花后10 d的13%和25%;种仁发育初期,’紫花刺芡’EfSBE1的表达量总体低于’紫花苏芡’,而中后期,’紫花刺芡’EfSBE1的表达量高于’紫花苏芡’。