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水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)基因组的第十一号片段编码一个20KD的非结构蛋白Pns11。它具有序列非特异的单、双链DNA、RNA结合活性。在其N端的47—61位氨基酸存在一个CyS2—CyS2锌指模式序列。Pns11的C端的5个碱性氨基酸富集区和CyS2—CyS2锌指模式序列对维持Pns11的核酸结合活性是必需的。本论文通过烟草叶片瞬时表达、转基因烟草组成性表达以及RDV感病水稻细胞免疫电镜的观察,对Pns11细胞定位研究结果得到了一致结果,即该蛋白定位于细胞核和质体;同时通过缺失突变的方法将Pns11的核定位信号定位在其131—181氨基酸区域内,并且该区域中的丝氨酸对于Pns11的叶绿体定位十分重要。在瞬时表达系统和病毒表达系统中,Pns11均表现抑制正义链GFPRNA诱导的RNA沉默的活性。进一步的研究表明,在异源病毒表达载体PVX中,Pns11还具有抑制病毒诱导的RNA沉默的活性,使得PVX在感病植株中病毒的基因组积累量增加,而且Pns11的核定位信号对于Pns11的RNA沉默抑制活性是必须的。如果缺失了Pns11的核定位信号,Pns11就丧失了抑制正义链GFP RNA诱导的RNA沉默的能力。
本论文以Pns11为诱饵,通过酵母双杂交系统筛选健康的水稻cDNA文库,获得了与Pns11相互作用的阳性克隆。该克隆的序列分析表明,其编码的是水稻支链氨基酸转胺酶(BCAT)的N端部分。半定量RT—PCR分析表明,与健康水稻相比,BCAT的转录水平在RDV感病水稻中受到了下调。进一步的研究表明,在Pns11:eGFP转基因模式烟草(Nicotiana tobacnm)中的同源基因NbBCAT的转录水平也受到了下调。
为了能对BCAT的功能进行深入的研究,本论文采用RT—PCR的方法克隆了烟草中的NbBCAT基因。该基因能够在酵母中互补BCAT的功能。Southern杂交结果表明NbBCAT是一个多拷贝基因。半定量RT—PCR结果显示,该基因在成熟叶片、新生叶片、花、茎、根和幼苗中均有转录,但在花与新生叶片中的转录水平最高。烟草叶片原生质体细胞中的瞬时表达结果说明,NbBCAT定位于叶绿体。本论文使用TRV病毒载体,通过VIGS的方法发现,在NbBCAT沉默的的植株中,新生叶片发育畸形并且植株的顶端优势丧失。半定量RT—PCR分析表明,NbBCAT的沉默引起了KNOX基因家族中的NTH15、NTH23的转录水平上调;同时细胞分裂素合成途径中的ipt基因以及赤霉素合成途径中的GA20—Oxidase的转录也分别受到了激活和抑制。ELISA激素测定的结果表明,NbBCAT沉默植株中的赤霉素和生长素的含量分别下降到对照的56.8%和37.6%,而细胞分裂素的水平则上升了60%。同时,外源施加激素的实验表明,NbBCAT的表达同样受到激素处理的抑制。
本研究发现,NbBCAT基因的沉默可以导致植株新生叶片发育畸形以及顶端优势丧失,对其分子机制的初步研究结果表明;NbBACT基因的沉默,引发了KNOX基因家族中的NTH15、NTH23的转录水平上调,导致受KNOX基因调控的ipt基因的转录水平上调了,GA20—Oxidase的转录下调,从而引起植物体内的赤霉素、生长素水平减少,细胞分裂素水平增加,最终导致NbBCAT基因的沉默植株新生叶片发育畸形以及顶端优势丧失表型的发生。