酵母对重金属的富集以及草鱼呼肠孤病毒YP7蛋白抗原表位的研究

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近年来环境污染问题已成为最受关注的问题之一。水体中重金属污染是一种持久性的,在生物体食物链中有比较明显的生物富集的一种水体污染。因此探究重金属富集的方法及原理,快速高效的降低水体中重金属离子是本研究注焦点之一。本研究的第一部分工作利用野生型酿酒酵母菌株及七基因缺失突变型酵母菌株,研究了不同基因型酵母株在不同的活性状态下对重金属Co2+和Cd2+的富集。结果显示,在磷酸盐缓冲液(PBS)中,酵母处于生长基本停止状态,两种酵母菌株都对Co2+和Cd2+表现出比较强的被动吸附能力,但野生型酵母的富集效率优于七基因缺失突变酵母株。说明酵母在PBS中对重金属的富集主要是依靠被动吸附机制,且与细胞的表面结构有关。在限制性培养基中,酵母的生长状态较好,野生型酵母对Co2+表现出了较好的主动富集现象,并且在暴露96h时达到富集高峰,而七基因缺失突变酵母株中Co2+的含量随时间推移变化不大。在对Cd+的富集过程中,七基因缺失突变型酵母表现出较野生型酵母更快速富集的效果。研究结果为利用酵母富集环境中重金属的实际应用提供了新的参考数据,提示对于不同环境下的不同毒性的重金属离子,可以采取不同的富集方法,针对性地设计应用方案。  本研究的第二部分研究工作是利用识别草鱼呼肠孤病毒(Grass CarpReovirus,GCRV)衣壳蛋白VP7的单链抗体探究VP7的抗原表位。通过对GCRV的电镜图片与3D模型分析比较,发现GCRV与MRVs有很大的相似之处。结合氨基酸序列同源性分析,VP7蛋白与MRVs的63具有部分同源序列,推测VP7蛋白可能与63一样,在病毒的识别侵染上有重要作用。在本实验室的前期工作中,利用原核表达的VP7蛋白对大容量噬菌体展示鼠源天然单链抗体文库进行淘选,最后得到了一株识别的位点为线性表位且专一性识别VP7的单链抗体19B7。进一步的中和实验鉴定发现噬菌体展示的单链抗体19B7对GCRV具有中和效应。为了探究单链抗体19B7结合在VP7上的抗原表位,将VP7蛋白进行了分段表达,通过对19B7单链抗体对各个片段的结合特异性分析,确定单链抗体19B7的识别位点在VP7的N端-C端共276个整段氨基酸序列中位于166-191氨基酸序列中的25个氨基酸的区域内,这也为深入探讨病毒与细胞的结合位点提供了一种新的研究手段。另一方面,还将VP7分段表达的蛋白纯化,对噬菌体展示抗体文库进行了淘选,以期获取更多的高亲和力、高特异性以及高表达量的单链抗体。最终淘选到三个分别能识别VP7蛋白A和C片段的抗体。这将为GCRV的检测及其与宿主细胞的相互作用研究提供更加充足的工具。通过可溶性表达的单链抗体19B7-Fc对GCRV病毒的中和作用的验证性实验,表明可溶性表达的单链抗体19B7没有中和病毒的作用,说明前期实验中噬菌体展示形式的单链抗体的中和病毒的作用可能是因为噬菌体的空间位阻效应所致。这为预防错误的研究方向提供了有价值的研究结果。
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