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目的：
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是引起获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）的病原体。人类免疫缺陷病毒(HIV)主要侵犯免疫系统的CD4+T淋巴细胞，造成机体免疫功能下降，最终因患各种机会性感染或肿瘤而死亡。近年来，HIV在男男性接触间的传播以惊人的速度蔓延，年增长率远远超过了其他高危人群，因此众多学者展开了针对经男男性接触者传播的HIV感染人群AIDS的发病、疾病进展等方面机制的研究，以此探索经男男性接触者传播的HIV感染人群中AIDS的预防、治疗等方面的信息。在HIV感染过程中，免疫系统一方面受到病毒感染的损害，细胞数量和功能发生变化，另一方面依旧发挥抗病毒的功能，抑制病毒复制。自然杀伤细胞(naturalkiller cell，NK)是天然免疫系统中的重要效应细胞，在控制肿瘤和微生物感染中发挥重要作用。NK细胞的主要功能是通过多种机制溶解杀伤靶细胞，例如:释放毒性颗粒;通过Fas配体介导靶细胞凋亡;抗体依赖的细胞毒作用(ADCC，antibodydependent cellular cytotoxicity)，并且活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫、造血以及直接杀伤靶细胞的作用。
ADCC是在肿瘤或病毒特异性IgG抗体存在的条件下，NK细胞可通过表面CD16分子即IgG Fc受体(FcγRⅢ)介导，识别杀伤与IgG抗体特异性结合的肿瘤或者病毒感染的靶细胞。在HIV感染者中NK细胞介导的ADCC效应是否能够抑制病毒的复制，报道结果不尽相同。Gomez-Roman等人发现在HIV感染者中ADCC反应能够抑制病毒的复制，即HIV病毒的复制水平与ADCC效应成负相关。Dalgleish A等人发现HIV病毒的复制水平与ADCC效应两者之间无相关性。关于HIV原发感染阶段ADCC效应研究甚少，一篇文献报道推测了猿猴体内ADCC效应3周就会产生。关于HIV感染者NK细胞ADCC效应出现时间和较早出现ADCC效应对HIV疾病进展的影响，这些问题还需进一步探索。对于经男男性接触途径传播的HIV感染者(MSM) NK细胞ADCC应答的特异性抗原尚无报道，明确MSM中NK细胞ADCC应答的HIV特异性抗原表位，对于HIV疫苗研制具有重要意义。
为明确NK细胞ADCC效应在HIV感染中的特征，探索NK细胞ADCC效应在HIV感染者体内出现的时间以及针对MSM人群，标记出NK细胞ADCC效应识别的特异性线性抗原表位，本研究主要应用胞内细胞因子染色(ICS)技术，对原发、慢性及HAART治疗者的HIV感染者NK细胞ADCC效应进行研究，以此探讨其在HIV感染过程中变化情况，为艾滋病的预防以及疫苗的研究提供信息。
材料与方法：
一、研究对象
选取51例HIV感染者，来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊，以上HIV感染者均经男男性接触途径传播。根据感染阶段不同，分为HIV原发感染(primary HIV infection，PHI)组、慢性感染(Chronic HIV infection，CHI)组和高效抗逆转录病毒治疗组(Highly active antiretroviral therapy，HAART)。其中本研究的PHI人群平均感染时间为95天。
二、CD4+T细胞绝对值检测
将20μlBD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中，逆向加样法加入50μl混匀的抗凝全血，室温避光15min，加入1×免洗溶血素450μl，室温避光15min，应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，MultiSET软件分析结果，得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。
三、NK细胞ADCC功能的检测
将HIV感染者全血200ul、Env肽段5ug/ml或者gp1205ug/ml、Brefeldin-A1ul/ml(BD Cat.555029，USA)、 Monensin0.7ul/ml(BD Cat.554724，USA)于培养孔中混匀，在CO2培养箱中培养5小时。每个标本都设有阴性对照（无刺激物）和阳性对照PMA(Sigma，Cat.No.P-8139)和Ionomycin(Sigma，Cat.NO.Ⅰ-0634)终浓度分别为50ng/ml and1uM;将培养板中的细胞转移到流式管中，溶血，离心洗涤细胞两次，表面标志CD3、CD56染色;4℃避光染色30分钟，离心洗涤细胞;破膜后，进行胞内IFN-γ染色;用1％的多聚甲醛固定细胞;使用BD LSRⅡ流式细胞仪及BD FACSDiva TM软件检测并分析NK细胞分泌IFN-γ情况。为了测定无非特异ADCC反应，我们同时对10例HIV抗体阴性健康者进行了上述检测，其性别、年龄均与HIV感染者匹配，HIV抗体阴性，血常规及肝肾功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性，无免疫系统疾病史。
通过NK细胞的活化程度来判定NK细胞ADCC效应，NK细胞ADCC效应阳性必须同时满足以下两个标准:第一，肽段或者gp120蛋白刺激后NK细胞分泌IFN-γ高于未刺激时的三倍;第二，用肽库刺激10例HIV阴性健康者全血中的NK细胞，得出刺激正常人全血中NK细胞分泌IFN-γ的均数和标准差，HIV感染者的NK细胞分泌IFN-γ要大于以上求得的均数加上两倍标准差之和。
四、定位NK细胞ADCC效应识别的HIV特异性线性表位
将NK细胞ADCC效应阳性的肽库采用矩阵的方法进一步拆分，最终确定出NK细胞ADCC效应识别的HIV特异性线性表位。
五、HIV病毒载量测定
采用Roche公司The COBAS(R) AmpliPrep(R)/C OBAS(R) TaqMan(R)HIV-1 Test试剂盒在COBAS(R) TaqMan(R)系统进行全自动PCR反应体系制备及病毒载量检测。
六、统计学分析
应用SPSS17.0软件包进行统计分析，所有数据以中位数表示，两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义。
实验结果：
一、NK细胞对Env区肽段ADCC应答情况
在健康对照及HIV不同感染人群中，初步分析NK细胞ADCC效应，结果显示:在正常对照组中，NK细胞对HIV特异性肽段未产生ADCC应答，对各个肽库均数加上两倍标准差之和结果分别为:Pool1:0.37+2*0.41; Pool2:0.51+2*0.57;Pool3:0.40+2*0.32; Pool4:0.33+2*0.31; gp120:-0.04+2*0.154;根据这个标准，获得的结果为:20％的原发感染者(PHI)、47.6％的慢性感染者(CHI)、50％的抗HIV逆转录病毒者(HAART) NK细胞对gp120或至少1个HIV Env肽库产生ADCC应答。PHI组识别的特异性Env肽段分布比较广泛C1V1V2C2V3C3V4C4V5，CHI组识别的特异性Env肽段为C1V1V2C2V3C6C7，HAART组识别的特异性Env肽段为C1V1V2C6C7。
二、NK细胞ADCC应答与病毒载量和CD4+T细胞计数分析
本研究将肽段（提供抗原）和HIV感染者全血(NK细胞和抗体)共培养5h，采用胞内细胞染色方法，通过NK细胞活化后分泌IFN-γ来检测其ADCC应答有无，比较HIV感染者中NK细胞ADCC应答有无两组的病毒载量和CD4+T细胞计数是否有差异。结果显示:在HIV感染者(包括PHI、CHI、HAART)中，NK细胞ADCC应答组病毒载量明显低于无应答组(P=0.009)，CD4+T细胞计数在两组间无差异(P=0.689);在原发感染者中，NK细胞ADCC应答有无两组的病毒载量和CD4+T细胞计数均无差异，但在HIV慢性感染者中，NK细胞ADCC应答组病毒载量明显低于无应答组(P=0.006)，CD4+T细胞计数在两组间无差异(P=0.605)，在HAART组中，NK细胞ADCC应答有无两组的病毒载量和CD4+T细胞计数均无差异
三、HIV感染者NK细胞ADCC效应与HIV感染时间的关系研究
感染天数和NK细胞ADCC应答的结果为51例HIV感染的患者中，19例NK细胞对gp120或者至少1个HIV Env肽库产生ADCC应答，其中NK细胞对gp120蛋白产生ADCC应答的时间为HIV感染24天，对Env肽段产生ADCC应答的时间为HIV感染的40天。根据HIV感染时间的长短，分析NK细胞ADCC效应与感染时间的关系。结果显示:HIV感染的时间与NK细胞ADCC效应呈正相关(P=0.017，R=0.334);按照感染时间＜1年、1-3年、＞3年分组，可见NK细胞ADCC效应在感染时间＞3年组明显高于＜1年的感染组(P=0.024)，而感染时间在1-3年组与＜1年组相比NK细胞ADCC效应无差异，与＞3年组相比，NK细胞ADCC效应也无差异。
四、CD16分子在NK细胞的ADCC效应中作用研究
分析表达CD16分子NK细胞数量与NK细胞ADCC反应的相关性，以研究CD16分子在NK细胞的ADCC效应中作用，结果显示:HIV感染者NK细胞ADCC效应与表达CD16分子的NK细胞绝对计数成正相关(P=0.027，R=0.471)。
五、NK细胞ADCC效应识别的HIV病毒特异性抗原表位分析
HIV感染者NK细胞对HIV Env区不同肽池（每个肽池包括38-40个单肽）以及gp120蛋白ADCC效应初步分析，结果显示:在19例NK细胞ADCC应答中，有42.1％(8/19)识别Pool1，5.8％(3/19)识别Pool2，10.5％(2/19)识别Pool3，26.3％(5/19)识别Pool4，有47.4％（9/19)识别gp120。
NK细胞ADCC抗体识别HIV Env区特异性抗原表位的定位结果如下:第119号肽，位于gp41结合性环肽(NHR)，对应序列为KIEPLGVAPSRAKLT;第27号肽，位于gp120(C1)区，相应的氨基酸序列是:TDIISLWDQSLKPCV;第41号肽，位于gp120(V2)区，相应的氨基酸序列是:SLFYKLDVVQINEKN;第10号肽，位于gp120(C1)区，相应的氨基酸序列是:VYYGVPVWKDAETTL;第14号肽，位于gp120(C1)区，相应的氨基酸序列是:CASDAKAYDTEVHNV。
结论：
1、HIV感染者中有ADCC反应组病毒载量低于无反应组，在慢性未治疗人群中差异明显，提示HIV感染者中NK细胞介导的ADCC反应可能是抑制病毒的复制的因素之一。
2、20％的原发感染者(PHI)、47.6％的慢性感染者(CHI)、50％的抗HIV逆转录病毒者(HAART)NK细胞对gp120或至少1个HIVEnv肽库产生ADCC应答，HIV早期感染者存在NK细胞对HIV gp120和Env肽段的ADCC效应，并且随着HIV感染时间的延长，ADCC反应逐渐增强。
3、首次标记出针对MSM人群NK细胞ADCC效应识别的5个HIV特异性线性抗原表（eg.VYYGVPVWKDAETTL）为抗HIV疫苗的研发提供设计思路。