【摘 要】
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基质金属蛋白酶(MMP)因其在肿瘤的生长、转移和血管生成等多个环节中发挥着重要作用而成为肿瘤治疗研究中引人注目的靶点。Ⅳ型胶原酶作为MMPs家族中的重要成员之一，可以通过降解Ⅳ型胶原等胶原底物破坏基底膜和细胞外基质的完整性，从而有利于肿瘤的生长、转移和血管生成。一般来说，在肿瘤细胞及其邻近的间质组织中，Ⅳ型胶原酶的表达和活化显著增加，并且这种增加与肿瘤的恶性表型呈正相关。以其为分子靶点，发展的多种
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基质金属蛋白酶(MMP)因其在肿瘤的生长、转移和血管生成等多个环节中发挥着重要作用而成为肿瘤治疗研究中引人注目的靶点。Ⅳ型胶原酶作为MMPs家族中的重要成员之一，可以通过降解Ⅳ型胶原等胶原底物破坏基底膜和细胞外基质的完整性，从而有利于肿瘤的生长、转移和血管生成。一般来说，在肿瘤细胞及其邻近的间质组织中，Ⅳ型胶原酶的表达和活化显著增加，并且这种增加与肿瘤的恶性表型呈正相关。以其为分子靶点，发展的多种小分子Ⅳ型胶原酶抑制剂在恶性肿瘤的治疗中显示出确切的疗效。本论文利用两种Ⅳ型胶原酶抑制剂筛选模型寻找活性天然产物及化合物。从活性微生物发酵液中分离得到了两个大分子多糖。对筛选得到的喹诺酮类化合物进行了体外肿瘤细胞增殖和侵袭转移的抑制活性评价。
第一部分间接ELISA法Ⅳ型胶原酶抑制剂筛选模型的应用及荧光底物法Ⅳ型胶原酶抑制剂筛选模型的建立
根据竞争性抑制单抗3D6与Ⅳ型胶原酶结合的化合物可能具有Ⅳ型胶原酶抑制活性的假设，采用间接ELISA的方法建立了Ⅳ型胶原酶抑制剂的高通量筛选模型。在使用间接ELISA法在大量的微生物产物和化合物中筛选Ⅳ型胶原酶抑制剂的过程中，发现该模型与明胶酶谱检测之间缺乏很好的平行性。为此，建立了荧光底物法的Ⅳ型胶原酶抑制剂筛选模型。该模型机理是，MMP对小肽底物的水解解除了Dnp对Try荧光核的荧光淬灭作用，荧光值的变化反映了MMP酶解能力的强弱，从而可以定量评价样品对MMP酶活性的抑制能力。对该模型的反应条件进行了优化，使之符合高通量筛选的要求。利用荧光底物模型对在几个间接ELISA法模型上的阳性化合物和多糖进行了活性评价和比较，结果显示与明胶酶谱检测的平行性较好，初步证明了模型的有效性。
第二部分H25抑制HT1080细胞增殖和侵袭转移活性的体外评价及抗侵袭作用机理的初步探讨
喹诺酮类化合物H25是从间接ELISA法Ⅳ型胶原酶抑制剂筛选模型中筛选得到的，在荧光底物法模型中也表现出很好的活性，明胶酶谱检测证明其有竞争性抑制Ⅳ型胶原酶的作用。本论文中，多方面评价了H25的体外抗肿瘤细胞增殖和侵袭转移的活性，并探讨了其抗侵袭作用可能的机理。
实验结果证明，H25对肿瘤细胞有一定的增长抑制作用，并具有明显的抗肿瘤侵袭转移的作用。进一步的实验发现H25可能是在转录后水平实现对细胞MMP-2和9的抑制。其明确的作用靶点尚有待更深入的研究。
第三部分微生物多糖1519A和3748A的分离
1519A和3748A，是从真菌1519和3748发酵液中分离得到的大分子多糖。它们是通过间接ELISA法Ⅳ型胶原酶抑制剂模型筛选得到的。其中1519A在荧光底物法Ⅳ型胶原酶抑制剂模型上也有较好的活性，明胶酶谱分析呈阳性结果。这证明1519A具有竞争性抑制Ⅳ型胶原酶的活性。1519A和3748A还具有显著的抑制HIV逆转录酶的活性。对1519的结构研究表明其为分子量约为120万的大分子葡聚糖。
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