源自家庭农场病猪的猪链球菌分子分型与毒力评价

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猪链球菌病是链球菌属中马链球菌兽疫亚种、马链球菌类马亚种、兰氏分群中D、E、L群链球菌以及猪链球菌(Streptococcus suis,SS)引起猪的疫病总称。临床表现主要为败血症、化脓性淋巴结炎、肺炎、脑膜炎以及关节炎等。20世纪50~60年代猪链球菌病在我国即有出现,是养猪生产中的常见病和多发病。近二十多年来,随着规模化养猪业的发展,猪链球菌病的发生率不断上升,并与一些其他疾病继发感染或混合感染,如猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪瘟、猪伪狂犬病、副猪嗜血杆菌病、传染性胸膜肺炎等,导致病死率的大幅提高,给养猪生产造成了较大的经济损失。因此,我国农业农村部将猪链球菌病列为二类动物疫病。SS是引起猪链球菌病的主要病原,血清型众多,流行的优势血清型一直呈动态变化,不同血清型菌株之间缺乏交互免疫力,基因型复杂多样,不同菌株之间存在遗传学差异,毒力强弱也差异明显,给猪链球菌病的防控带来了巨大困扰。本研究对源自某集团公司分布在安徽、江苏、山东、河北、广西等五省区家庭农场中的55株SS分离株进行血清分型、毒力基因分型、多位点序列分型(MLST)和毒力评价,旨在探究SS血清型、毒力基因型、MLST基因型的分布特点及其与毒力之间的关系,从而为该集团公司科学防控猪链球菌病提供合理依据和技术支持。本研究将55株SS分离株作为受试菌株进行如下试验:(1)合成SS的35种血清型特异性引物,采用PCR技术对SS分离株进行血清分型;合成SS的6个毒力基因(mrp、epf、sly、orf2、fbps、gapdh)引物,采用PCR技术对SS分离株进行毒力基因分型;合成SS的7个管家基因(aro A、cpn60、dpr、gki、mut S、rec A、thr A)引物,采用PCR技术对SS分离株进行MLST分型,并构建UPGMA系统发育树分析不同地区分离株之间的亲缘关系。(2)以昆明鼠为动物模型,对SS分离株进行致病性试验,筛选出致死率为100%的分离株,并采用累积法测定其LD50。结果显示:(1)55株SS分离株共有9种血清型和未定型,SS4为优势血清型,19株,占比34.5%;共有11种毒力基因型,epf-mrp-sly-gapdh+fbps+orf2+为优势毒力基因型,16株,占比29.1%,SS4的优势毒力基因型为epf+mrp+sly+gapdh+fbps+orf2+;共有21种ST型,ST94为优势ST型,21株,占比38.2%,其中11种ST型为首次发现,存在3个以上等位基因突变,多数同一ST型SS分离株只能对应一种血清型,但同一血清型分离株存在多个ST型,ST1229(江苏及河北分离株)与ST1233(山东分离株)亲缘关系较近,ST94(安徽、江苏及河北分离株)与ST108(河北及江苏分离株)亲缘关系较近。(2)55株SS分离株共筛选出11株致死率为100%的分离株,分别为HBgu18-3(SS4)、HBgu18-4(SS4)、AHhuai18-10(SS4)、AHhuai18-8(SS4)、JSxu18-4(SS4)、AHfu18-1(SS7)、HBgu18-2(SS7)、AHshou18-1(SS4)、JSbin18-1(SS8)、JSxu18-10(SS4)、JSbin18-8(SS8),其LD50分别为3.39×108CFU/m L、3.54×108CFU/m L、4.57×108CFU/m L、5.01×108CFU/m L、5.17×108CFU/m L、5.37×108CFU/m L、5.62×108CFU/m L、1.0×109CFU/m L、1.67×109CFU/m L、3.0×109CFU/m L、4.47×109CFU/m L。结果表明:(1)该集团公司五省区家庭农场流行的SS血清型种类较多,不同省区流行的血清型有明显差异,SS4为优势血清型;毒力基因型具有多样性,epf-mrp-sly-gapdh+fbps+orf2+为优势毒力基因型,SS4的优势毒力基因型为epf+mrp+sly+gapdh+fbps+orf2+,epf、mrp及sly为毒力差异性基因;ST型呈现多元化趋势,ST94为优势ST型,遗传变异较为明显,种内分化程度较高,ST型与血清型之间存在一定的交叉性,且临近地区的分离株具有较高的同源性。(2)该集团公司五省区家庭农场流行的SS中共有8株强毒株,1株中等毒力菌株,2株弱毒株;其中SS4毒力最强,其次为SS7和SS8;同种血清型中ST94分离株的毒力最强;多数分离株携带的毒力基因种类越多,毒力越强。
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