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大鼠蛛网膜下腔出血后血清中IL-17含量的变化和意义探讨目的颅内血管破裂后，血液流入蛛网膜下腔时，称为蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage SAH)。国内资料统计SAH占脑血管病总发病率的9％-22.4％。脑血管痉挛(Cerebral Vasospasm CVS)是导致SAH病人死亡和伤残的重要原因。CVS分为两种：一是SAH后破入脑脊液中的血液对脑血管的机械性刺激所致的暂时性或早发性CVS，二是持续时间较长的、目前机制尚未明了的继发性CVS或称为迟发型CVS(Delayed Cerebral Vasospasm DCVS)，而在临床上以DCVS多见。近年来有些学者认为免疫因素在SAH后DCVS的发生机制中起着重要的作用。并且有文献报道，脑动脉周围的血凝块分解代谢产物促使CVS的发生；脑动脉壁继发的免疫反应为主的病理过程使CVS程度进一步加重，从而为探讨CVS的发病机制及其治疗开辟一条途径。白介素17(IL-17)是一种强大的前炎症细胞因子，也是炎症反应的微调因子。IL-17可以刺激多种细胞分泌细胞因子，也可以与多种细胞因子产生协同作用以放大炎症反应。有文献研究表明在缺血性脑卒中患者IL-17水平升高，其细胞数与神经系统损害程度和转归密切相关。本研究通过枕大池二次注血法制作SAH模型，检测血清中IL-17含量的变化，探讨其与脑血管痉挛的关系。实验材料和方法一、材料1、试剂及实验设备大鼠白介素—17酶联免疫试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)、水合氯醛、多聚甲醛、苏木素、伊红、激光多普勒血流仪(PF3瑞典PERIMED公司生产)、石蜡切片机、酶标仪、恒温水浴箱、离心机、微量移液器、手术器械、电子天平、冰箱、显微镜等。2、实验对象选用健康Wister大鼠40只(中国医科大学实验动物中心提供)，雌雄不限，体重300—350g，将动物随机分为2组：①假手术组(NS，20只)：经大鼠枕大池注入生理盐水：②注血组(SAH，20只)：经大鼠枕大池注射新鲜无抗凝自体动脉血。二、方法1、动物模型的建立采用经枕大池二次注血法制作蛛网膜下腔出血动物模型：将大鼠用10％水合氯醛(40mg／100g)腹腔内麻醉，无菌条件下沿中线逐层切开枕部皮肤、肌肉，显露枕骨与C1棘突连接处，找到环枕筋膜，无菌纱布覆盖；然后切开腹部皮肤，从股动脉抽取0.3ml自体血，经环枕筋膜自枕大池抽出0.3ml脑脊液后，将0.3ml自体血缓慢注入枕大池。在注血完毕时，可以观察到大鼠的呼吸节律发生明显改变，甚至可看到呼吸暂停。立即保持头低位30min，以促使其自体血弥散于基底池，确保于针孔处无明显漏血、漏液后，缝合肌肉及皮肤，消毒。卫生饲养。48小时后重复上述操作，第二次注血。假手术组以生理盐水代替自体血，其余步骤同上。2、rCBF的测量各组实验动物在处死前经腹腔麻醉，切开颅顶正中皮肤，在大鼠前囟后、中线左侧各3mm处用牙科钻钻一直径3mm的小型骨窗，保持硬膜完整，将激光多普勒血流仪直径2.5mm的探头垂直置放于硬脑膜上测量局部脑血流，并记录。实验数据用统计学分析。3、IL-17的测定(1)IL-17标本的提取实验动物在二次注血后第2、3、5、7天各采取外周血1ml置EP试管中，-20℃保存。待标本都采集完毕后，取出标本在室温下自动融化。待融化完毕后在4℃3000r／min下离心15min后取清液。(2)方法采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用酶标仪在492nm处测OD值，用SOFTMax软件(中国医科大学免疫实验室提供)处理OD值，得出相应大鼠IL-17含量。4、动物情况观察动物是否存活，存活动物的一般状况，包括自沽情况、摄食、饮水量以及惊厥等现象。动物按规定的时间处死后做颅底解剖观察及病理观察。5、动物处死及解剖、病理观察。各组实验动物测量rCBF后，开胸，于心尖处穿刺逆行插管，同时剪开右心耳，灌注37℃生理盐水200—300ml，排出全身血液至右心耳流出清亮液体。之后开颅，观察注血情况及颅底解剖结构。于C1水平离断脑干，于脑桥中部水平分成两半，其中下一半脑干置于4％多聚甲醛溶液中固定24小时，经液体石蜡包埋待测。将石蜡标本切片行H．E染色后于40倍光镜下观察基底动脉情况。6、统计学处理以上所测得的数据以均数±标准差((?)±s)表示，利用spss12.0软件进行数据分析，各个指标进行t检验，p＜0.05认为差异有统计学意义，并分析各指标间的相关性。实验结果1、rCBF在注血组中于2、3、5天较同时期假手术组明显降低(p＜0.05)，而第7天时两者无统计学差异(p＞0.05)。2、在光镜下可见到SAH组的基底动脉外膜有较多的炎性细胞侵润、出血，内皮细胞变性、坏死，弹力膜皱折、断裂，平滑肌纤维变性、坏死等，而在NS组未见到这些变化。3、注血组于2d时IL-17的含量较假手术组明显增高(p＜0.01)，第3d时IL-17的含量到达最高(p＜0.001)，之后呈逐步下降趋势，到第7d时IL-17的含量较假手术组差异仍较明显(p＜0.05)。结论蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛是常见的并发症，IL-17是继发脑血管痉挛重要的血管活性物质之一，参与了蛛网膜下腔出血的病理生理过程；提示IL-17拮抗剂用于治疗蛛网膜下腔出血及预防其所致脑血管痉挛将是一条可能途径。