人脐带间充质干细胞外泌体预防子宫内膜损伤后纤维化的初步研究

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目的:在前期建立大鼠子宫内膜损伤模型的基础上,运用人脐带间充质干细胞外泌体静脉注射,修复损伤后的大鼠子宫内膜,探讨其疗效及机制,寻求新的宫腔粘连治疗方法。  方法:1、运用无血清培养基培养人脐带间充质干细胞,运用EXOQuick-TC试剂盒,提取外泌体。BCA试剂盒测定外泌体蛋白质浓度,westernblot检测外泌体特异性膜蛋白CD9、CD81。2、建立大鼠宫腔粘连模型:通过常规阴道涂片选择动情期Wistar大鼠,采用自制微型刮匙模拟刮宫术,随机分成两组(各15只)。实验组:手术后立即给予人脐带间充质干细胞外泌体悬液股静脉注射,对照组:手术后立即给予同等剂量的无菌PBS液。实验组及对照组分别予1天、3天、7天收集子宫标本。常规石蜡包埋及冰冻后备用。将准备好的石蜡包埋组织切片,进行HE染色、天狼星红染色以及免疫组织化学染色TGF-β1、MMP-9、a-SMA、VEGF、Ki-67、CD45检测。将冰冻组织提取蛋白,进行TGF-β1 western blot检测。采用Imageplus-pro和Image-J进行图像分析比较,采用spss22.0进行数据统计分析。  结果:1、体外培养的人脐带间充质干细胞接种24h后全部贴壁,呈纺锤形或梭形,有散在分布的细胞集落形成。2~3天进行一次传代。外泌体膜表面表达CD9和CD81。2、大体标本观察、HE染色观察、天狼星红染色观察发现实验组修复情况优于对照组。3、TGF-β1的表达:在损伤后24小时,实验组表达量高于对照组(p<0.05);至损伤后72小时,对照组表达量增加,实验组表达量减少,且对照组表达高于实验组(p<0.05);至损伤后第7天,实验组与对照组表达量均有所下降,对照组表达量高于实验组(p<0.05)。4、MMP-9的表达:损伤后24小时,两组表达量均较少,无统计学差异(p>0.05);至72小时两组表达量明显增加,对照组表达量显著高于实验组(p<0.05);至第7天对照组表达量继续增加,而实验组表达明显减少,两者有明显统计学差异(p<0.01)。5、a-SMA的表达:损伤后24小时,对照组表达量高于实验组,两组间有统计学差异(p<0.01);至损伤后72小时实验组表达量轻度增加,而对照组表达量增加更为显著(p<0.01);至损伤第7天,两组表达量均减少,两组间无明显统计学差异(p>0.05)。6、Ki-67的表达:损伤后24小时,实验组表达量显著高于对照组(p<0.05);至损伤72小时,两组表达量均有增加,但实验组仍明显高于对照组(p<0.05);至损伤第7天,实验组表达量明显下降,两组间表达量无统计学差异(p>0.05)。7、VEGF的表达:损伤后24小时,实验组表达量明显高于对照组(p<0.05);至损伤72小时,两组表达量均有增加,且对照组明显高于实验组(p<0.05);至损伤第7天,实验组表达量明显下降,但对照组表达仍显著高于实验组(p<0.05)。8、CD45的表达:至损伤后24小时,实验组表达量明显低于对照组(p<0.05);至损伤72小时,两组表达量均有降低,但实验组表达量明显低于对照组(p<0.05);至损伤第7天,实验组和对照组表达量明显下降,两组间无统计学差异(p>0.05)。  结论:1、无血清培养基培养脐带间充质干细胞传代速度快,至5代时细胞形态无变化。2、EXOQuick-TC试剂盒提取外泌体操作较梯度离心法简便,可一次性提取大量外泌体。3在子宫内膜损伤早期给予hucMSC-EXO干预后可以促进子宫内膜血管再生,促进细胞增殖,减少细胞外胶原纤维的产生,减少白细胞浸润,从而促进子宫内膜的修复和再生。
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