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双歧杆菌（Bifidobacterium）是可以定居在人和动物肠道内最重要的一种正常的共生菌，对任何动物体内的生物屏障、预防腹泻、免疫、改善乳糖不耐症、控制内毒素血症、抗肿瘤、治疗便秘、降低胆固醇以及延缓衰老等生理过程中发挥着重要的作用，也是目前微生态学研究的核心。研究已经证实包括两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌等5种的双歧杆菌可以在人体及动物肠道中定植。双歧杆菌可以通过竞争性粘附作用定殖到上皮细胞，从而抑制肠道内致病菌的定植，并可以分泌细菌素类抑制病原菌侵袭的活性物质、产生有意的代谢产物如有机酸等，从而保护宿主的健康，近期有报道称双歧杆菌能够通过产乙酸来预防肠道感染。另外双歧杆菌还可以刺激宿主的先天免疫反应，使机体免受免疫性疾病的侵害。双歧杆菌在人出生时即可从母体获得，尤其是母乳喂养的婴儿肠道内含量最高，随着年龄的增长双歧杆菌的数量逐渐减少，因此如何让双歧杆菌持久定植在人体肠道内成为了一个研究的热点。由于双歧杆菌具有许多益生作用，因此在药品和食品上已得到了广泛的应用。 基因组分析表明，双歧杆菌具有利用广泛的碳水化合物进行生长的糖代谢基因，从而表明其在肠道的环境中的适应性。寡聚果糖FOS、GOS、棉子糖等已确定为益生因子，可以促进双歧杆菌在人和动物肠道内的生长，但目前对双歧杆菌如何进行糖代谢的分子机制还不清楚。 基于本实验室之前的工作基础，本研究进一步探索B.longum XY01的生理生化特性，进行了B.longum XY01糖代谢的研究。首先，明确了B.longumNCC2705能够利用包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖和甘露糖的六种单糖和FOS作为唯一碳源生长。测定生长曲线和发酵的pH变化，结果表明B.longum XY01不同于其它的双歧杆菌如B.longum NCC2705，在葡萄糖、FOS和半乳糖中生长最好。进一步研究在这三种糖源中的生长情况表明，B.longumXY01在半乳糖中的生长速率高于在葡萄糖中的生长速率，在FOS中生长速率最慢，表明菌株B.longum XY01在半乳糖中适应性更强，代谢更为旺盛。通过高效液相色谱技术分析B.longum XY01在不同糖培养基中代谢产物乳酸和乙酸的含量，测定结果显示，半乳糖发酵液中的乙酸和乳酸的摩尔比为1.53，FOS发酵液中的乙酸和乳酸的摩尔比为1.55，葡萄糖发酵液中乙酸和乳酸的摩尔比为1.57，符合正常的乳酸和乙酸的摩尔比例1.5-3.0。乳酸在半乳糖、FOS和葡萄糖发酵液中的含量分别为1.24g/L，1.19g/L，1.14g/L，乙酸在半乳糖、FOS和葡萄糖发酵液中的含量分别为1.27g/L，1.23g/L，1.21g/L。结果表明，在半乳糖培养基中培养的B.longum XY01乳酸和乙酸含量最高，且乙酸含量在3种糖发酵液中均比乳酸高，证明了B.longum XY01可以偏好性优先利用半乳糖作为碳源，且利用率高，产酸高。 为了确定B.longum XY01的糖代谢通路，我们对FOS、半乳糖和葡萄糖作为唯一糖源的培养基中生长的B.longum进行了比较蛋白质组学研究。B.longumXY01蛋白质等电点主要集中在pH4-7之间，所以在本实验中我们采用了pH4-7的胶条进行了双向电泳实验，从而获得了分辨率较好，重复性较高的全细胞蛋白双向电泳图谱。利用MALDI-TOF/TOF MS/MS质谱技术进行差异蛋白鉴定及功能分析。 将B.longum XY01在FOS和半乳糖中生长的全细胞蛋白双向电泳图谱分别与葡萄糖中生长的全细胞蛋白双向电泳图谱进行比对，发现有52个差异蛋白点，通过MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定，共鉴定到40个蛋白。 根据基因组注释中的COGs分类，这40个差异蛋白主要分为:翻译后修饰、蛋白质转换、蛋白分子伴侣、能量产生与转换、核苷酸运输和代谢、碳水化合物运输和代谢、氨基酸运输和代谢、辅酶运输和代谢、转录翻译。B.longum XY01在半乳糖和葡萄糖培养基中代谢相关的蛋白表达丰度更高，代谢相关蛋白是维持生命活动所必须的，证实B.longum XY01在半乳糖和葡萄糖中的生理代谢比在FOS中代谢旺盛。这些蛋白大多数都是位于细胞质内，另外，我们鉴定到1个信号肽蛋白，即BL1722，参与核苷酸运输和代谢。 对3种糖培养基培养的双歧杆菌代谢通路图做部分对比分析发现，在FOS中上调的蛋白多分布于氨基酸代谢途径，在葡萄糖中上调的蛋白多分布于嘌呤、嘧啶代谢等途径，在半乳糖中上调的蛋白多分布于糖酵解途径，半乳糖培养基中下调的蛋白多分布于氨基酸代谢途径，而这些代谢途径对微生物的生命活动都是极其重要的。 本实验所鉴定到的差异蛋白中，差异最显著的是在半乳糖中高丰度表达的BL0988丙酮酸激酶，它可以催化盐酸盐从磷酸烯醇式丙酮酸到ADP的转化，伴随着一分子丙酮酸盐和一分子ATP的产生，并可以催化产生乳酸和乙酸。另外BL0715转醛醇酶在FOS中表达水平显著升高，可以催化6-磷酸葡萄糖(6-P-Glu)与6-磷酸果糖(6-P-Fru)之间的相互转化，参与糖酵解中Bifid Shunt磷酸戊糖途径的第一阶段。BL0530酮醇还原异构酶是一种氧化还原酶，在FOS中表达水平也是显著升高的，它参与氨基酸的运输和代谢，同时也是直接催化葡萄糖和果糖相互转化的酶。 为了对差异表达蛋白丙酮酸激酶、转醛醇酶和酮醇还原异构酶进一步进行验证，我们提取了B.longum XY01在半乳糖、FOS和葡萄糖中培养的总RNA，分别对丙酮酸激酶、转醛醇酶和酮醇还原异构酶在转录水平上进行半定量RT-PCR分析和实时荧光定量PCR分析，结果都与蛋白质组学结果一致。 丙酮酸激酶、转醛醇酶和酮醇还原异构酶3个蛋白都参与了糖酵解途径，并且BL0530酮醇还原异构酶还参与了氨基酸代谢。BL0715和BL0530在FOS中上调，表明B.longum XY01在FOS中发酵时，糖代谢途径将FOS转化为葡萄糖，进而启动bifid shut代谢途径。BL0988在半乳糖中上调，在代谢过程中催化生成更多的乙酸和乳酸，表明B.longum XY01在半乳糖GARCH培养基中产酸最高，且对半乳糖利用率较高，与生长曲线相对应，且在3种糖发酵液有机酸含量的测定中，半乳糖发酵液中有机酸含量是最高的，验证了丙酮酸激酶在半乳糖中表达量的升高，从而使乳酸和乙酸含量升高。足以说明B.longum XY01在半乳糖中发酵时具有较高的产酸性和耐酸性，进一步证实B.longumXY01对半乳糖利用率更高，产酸更高，为预防肠道致病菌的感染和乳糖不耐症的改善提供理论基础。 综上所述我们得出以下几点结论:(1)B.longum XY01在GARCH培养基中生命代谢活动旺盛，适应在不同糖底物培养基中的生长环境，其中在半乳糖中生长速率较快，对半乳糖利用率较高，生理指标优于在其它两种糖培养基中的指标;(2)B.longumXY01在半乳糖发酵液中产生有机酸含量是3种糖发酵液中最高的，表明B.longumXY01在半乳糖培养基中具有更高的产酸性;(3)分别建立了B.longumXY01在半乳糖、FOS和葡萄糖培养基中发酵的全细胞蛋白双向电泳图谱;(4)鉴定了B.longum XY01在半乳糖、FOS和葡萄糖培养基中生长的全细胞蛋白双向电泳图谱中52个差异蛋白质点，明确了这些差异蛋白点来自40种蛋白，并对其进行了细胞定位、分类、功能预测等分析;(5)选取了部分差异蛋白进行RT-PCR和荧光定量PCR实验，在转录水平上验证了蛋白表达量的差异，为B.longum XY01对不同糖发酵的代谢途径研究奠定了基础。