论文部分内容阅读
格尔德霉素和除莠霉素属于苯醌型安莎霉素类抗生素，具有很强的抗肿瘤活性。对不同链霉菌中格尔德霉素基因簇序列的比较将增加对基因簇之间的进化和基因功能的认识。本文构建了自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)JX-47的基因组细菌人工染色体(BAC)文库，其平均插入片段在150kb。通过设计三对引物联合检测和克隆子末端测序的筛选方法，从BAC文库中得到三个分别携带格尔德霉素基因簇的克隆子。这三个克隆子联合覆盖250kb的基因组区域，对克隆子p4E9的插入片段全测序得到150227bp。与吸水链霉菌中格尔德霉素基因簇序列的比较，显示在聚酮合成酶及下游的后修饰酶区域具有相同的基因组织结构和很高的序列同源性，其DNA相似性在84-100％，氨基酸相似性在81-100％。但在聚酮合成酶的上游有明显的区别，只保留了ORF16，其它序列都被替换。这显示ORF16与聚酮合成酶和下游有很强的连锁关系，ORF16属于RhtB家族的转运基因，可能作为格尔德霉素的抗性或外排而参与格尔德霉素的生物合成，其它缺失的基因，包括gdmL和gdmX则与合成无关。
比较基因组学是后基因组时代一个重要的序列分析方式，在功能基因组学的研究中发挥重要的作用。本文在Streptomyces violaceusniger Tu4113基因组中发现了完整的除莠霉素生物合成基因簇，并在S.violaceusniger Tu4113的除莠霉素主基因簇下游约42kb的位置发现了与gdmF和gdmM同等功能的两个阅读框herF和herM。首次采用格尔德霉素与除莠霉素的侧翼序列比较的方式寻找这两个主基因簇缺失的后修饰功能基因。对两种主基因簇上游序列的比较发现潜在的负责格尔德霉素苯环17位氧甲基化修饰的两个阅读框，ORF63和ORF64。对两种主基因簇下游序列的比较发现潜在的负责除莠霉素脂肪链11位和15位氧甲基化修饰的三个阅读框，且这三个阅读框是与herF和herM排列在一起。在两种主基因簇下游的同源序列中，发现三个与FAD和NADH相关的阅读框，其中的1-2个可能参与脂肪链4、5位脱饱和修饰。
格尔德霉素和除莠霉素属于典型的聚酮类化合物。聚酮化合物是生物活性物质的重要来源，微生物基因组中普遍存在Ⅰ型模块化的聚酮合成酶。本文通过构建KS(酮基合成酶域)文库对南海沉积物六个不同位点的Ⅰ型聚酮类化合物产生菌多样性进行研究。六个沉积物样品中检测到含有聚酮合成酶基因的微生物11个门：Cyanobacteria、Planctomycetes、Actinobacteria、Chloroflexi、Alphaproteobacteria、Verrucomicrobia、Firmicutes、Deltaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Bacteroidetes，另有约50％的序列未确定类群。Actinobacteria和Alphaproteobacteria在六个样品中普遍存在。对六个沉积物样品的KS文库进行比较，显示每个样品的微生物产生的聚酮类化合物类型具有很强的地域特征。
放线菌能够产生丰富的聚酮类化合物。本文通过构建放线菌16S rDNA文库对六个南海沉积物中放线菌的多样性进行研究，文库共得到放线菌16S rDNA序列445条，分为三个亚纲：Acidimicrobidae(46.3％)、Actinobacteridae(18.4％)、Rubrobacteridae(0.2％)和未归类的(35.1％)；分为11个亚目、目及平行的科：order Solirubrobacterales(0.2％)、suborder Streptomycineae(1.3％)、suborderPropionibacterineae(1.8％)、suborder Pseudonocardineae(0.2％)、suborderFrankineae(0.9％)、suborder Corynebacterineae(2.5％)、suborderMicromonosporineae(0.7％)、suborder Micrococcineae(7.4％)、unclassified orderActinomycetales(3.4％)、order Acidimicrobiales(30.6％)、family Acidimicrobidaeincertae sedis(2.2％)和未归类的(48.8％)。0.03距离的OTU(可操作分类单元)为281个，标志着种的多样性；0.05距离的OTU为242个，标志着属的多样性。OTU的稀释曲线显示种和属的多样性仍有不断增加的趋势。系统发育分析在0.03距离的281个OTU中检测到22个科：Mycobacteriaceae、Micromonosporaceae、Pseudonocardiaceae、Nakamurellaceae、Pseudonocardiaceae、Geodermatophilaceae、Acidothermaceae、Streptomycetaceae、Microbacteriaceae、Intrasporangiaceae、Cellulomonadaceae、Jonesiaceae、Micrococcineae incertae sedis、Micrococcaceae、Thermomonosporaceae、Propionibacteriaceae、Nocardioidaceae、Acidimicrobidaeincertae sedis、Iamiaceae、Coriobacteriaceae、Acidimicrobiaceae、Solirubrobacteraceae，另有210个OTU不可归类。六个站位放线菌的多样性和丰度都存在很大的差异，每个站位具有自己地域特征的放线菌种群。E109、E308、E402北部三个站位比E420、E601、Y03南部三个站位的放线菌多样性和丰度都高。其中E402站位的放线菌多样性是最为丰富的。
南海沉积物中存在大量的新颖的放线菌和聚酮合成酶基因资源，宏基因组技术是对其进行研究和利用的重要方式。本文构建了南海E402位点深海沉积物的Fosmid宏基因组文库，得到文库克隆子20000个，平均插入片段在35kb，整个文库包含的序列长度达到700M。从三个方面对文库包含的微生物基因资源的多样性进行了初步分析。第一，电泳图谱显示了文库克隆子酶切片段的多样性。第二，对构建文库总DNA的微生物来源的多样性分析显示其至少来自15个细菌门：Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Epsilonproteobacteria、Gemmatimonadetes、Actinobacteria、Synergistetes、Firmicutes、Bacteroidetes、Nitrospira、Chloroflexi、Acidobacteria、Verrucomicrobia、Planctomycetes。第三，对177条克隆子末端序列基因功能的多样性进行了分析，其中42条序列属于不同的超家族(Superfamily)，79条序列属于不同的COG组(Clusters of Orthologous Group)。