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第一部分:富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5在肝细胞癌中的表达及其在肿瘤细胞生物学行为中的效应目的:此部分旨在分析富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)在肝细胞癌(HCC)中的表达量,探讨Lgr5的表达量与患者的临床病理资料以及预后的关系,观察Lgr5对肿瘤细胞生物学行为的效应。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)以及免疫印迹分析检测肝癌细胞系和肝细胞癌组织样本中Lgr5的达水平。通过免疫组织化学检测临床收集的肝细胞癌样本中Lgr5的表达情况。结合Lgr5的表达情况与收集到的肝癌患者的临床病理资料分析两者之间的相关性。通过Kaplan–Meier生存曲线分析Lgr5表达量水平与肝癌患者预后的联系。建立COX回归模型与单/多因素分析判别Lgr5是否为肝癌预后的独立因素。在肝癌细胞系SK-Hep1和HepG2中对Lgr5基因过表达或基因沉默,从而通过Transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验检测细胞的侵袭迁移能力,CCK8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖实验检测细胞的增值能力,免疫印迹法分析上皮-间质化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)相关蛋白以及裸鼠动物模型检测Lgr5对肝癌细胞肺内成瘤的能力。采用CCK8细胞毒性实验检测细胞对化疗药物的耐药性。结果:Lgr5的表达量在肝细胞癌组织中的表达量较癌旁组织增高。肝细胞癌患者肿瘤组织中Lgr5的表达量与肿瘤的大小(P<0.01),肿瘤的数量(P=0.03),巴塞罗那分期(BCLC stage)(P<0.01)以及门静脉癌栓(portal vein tumor thrombosis,PVTT)的形成(P<0.01)均呈显著的正相关。Kaplan–Meier生存曲线显示具有较高Lgr5表达量的肝癌患者具有更为不良的预后。COX回归模型与单/多因素分析提示Lgr5是影响肝癌患者预后的独立危险因素。Lgr5可以提高肿瘤细胞的侵袭迁移和增殖能力,以及促进肿瘤细胞对阿霉素的耐药。结论:Lgr5参与了肝癌的发生发展,是促进肝癌增殖转移的一个重要因素。同时Lgr5可望用于对肝癌患者预后的预测,以及是一个潜在的药物作用靶点。第二部分:富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5与程序性细胞死亡蛋白5之间的相互作用目的:此部分主要筛选和检测Lgr5的相互作用蛋白质,研究Lgr5介导肝癌细胞对化疗药物耐药的分子机制。方法:采用临床收集的肝癌组织样本构建肝细胞癌的c DNA文库,使用酵母双杂交实验以Lgr5为诱饵从中c DNA文库中筛选Lgr5的相互作用蛋白。然后在HEK 293t细胞中共转染能表达Flag-Lgr5和MYC-PDCD5融合蛋白的过表达质粒,通过免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光共定位验证两者之间的相互作用。在Lgr5表达量较高的Hep G2细胞中,通过免疫共沉淀,进一步验证内源性的Lgr5和PDCD5之间的相互作用。最后,采用GST-pull down验证Lgr5和PDCD5之间的相互作用。此外,运用RT-q PCR技术检测100例肝细胞癌组织及其配对癌旁组织样本中PDCD5的m RNA水平。运用Western blot和免疫组织化学分析肝癌组织样本中PDCD5的表达量水平。分析肝癌患者的肿瘤组织样本中PDCD5的表达量和患者的临床病理资料之间的联系。通过K-M生存曲线探讨PDCD5的表达量与肝癌患者总体生存期之间的联系。运用COX回归分析和单/多因素分析评估PDCD5在预测肝癌预后中的价值。在肝癌细胞系(SK-Hep1和Hep G2)中上调和敲低PDCD5的表达,运用CCK8细胞毒性检测试剂盒检测阿霉素对肝癌细胞的耐药性,使用细胞克隆形成实验检测肝癌细胞的增值能力。结果:通过酵母双杂交实验在以肝癌组织样本构建的c DNA文库中,以Lgr5作为诱饵捕获到了30种不同的蛋白质。经过分析验证,我们从中选取了PDCD5进行进一步的验证。经过在共转染了Flag-Lgr5和MYC-PDCD5过表达质粒的HEK 293T细胞中,通过免疫共沉淀验证了MYC标签抗体可以检测到通过Flag标签抗体从转染后的HEK 293T细胞中提取的蛋白质混合物中沉淀下来并经过洗脱的蛋白溶液中MYC-PDCD5的存在。反之,Flag标签抗体也可识别MYC标签抗体所沉淀下来的蛋白质中含有Flag-Lgr5。然后对转染后的HEK 293T进行免疫荧光实验并在共聚焦显微镜下观察到Lgr5和PDCD5共同定位于细胞质中相同的位置。在Hep G2细胞经非变性裂解得到的蛋白质溶液中,可以通过Lgr5抗体检测PDCD5抗体沉淀下来到蛋白中含有Lgr5,反之亦然。经过RT-q PCR,Western blot和免疫组织化学可以检测出PDCD5在肝癌组织中的表达较癌旁组织显著降低。肝癌组织中PDCD5的表达量与对应肝癌患者体内肿瘤的大小(P=0.03),巴塞罗那分期(BCLC stage)(P=0.01)以及PVTT的形成(P=0.01)均有显著的负相关。Kaplan–Meier生存分析提示PDCD5在肝癌组织中的高表达预示着良好的预后。COX回归分析和单/多因素分析说明PDCD5是影响肝癌预后的独立危险因素。PDCD5可以提高肝癌细胞对阿霉素的敏感性,在稳转Lgr5细胞中过表达PDCD5可以减弱Lgr5诱导的阿霉素耐药。结论:Lgr5与PDCD5之间存在蛋白质的相互作用,PDCD5参与了Lgr5介导肝癌细胞对化疗耐药的过程。第三部分:富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5通过竞争性结合程序性细胞死亡蛋白5调控肝癌细胞的化疗耐药目的:此部分主要旨在探索Lgr5如何通过与PDCD5相互作用继而调控肝癌细胞的耐药性。方法:我们通过RT-q PCR和Western blot对Lgr5和PDCD5能否影响彼此之间的m RNA和蛋白质水平进行了检测。采用细胞免疫荧光定位显微镜下观察Lgr5能否影响PDCD5在细胞中的分布。细胞核蛋白-胞浆蛋白分别抽提后采用Western blot检测PDCD5在细胞中的分布,Lgr5和p53的表达量的变化。采用免疫共沉淀验证在Lgr5过表达的细胞中,和PDCD5结合的p53的蛋白质水平。采用Western blot和免疫组织化学检测了肝癌组织中Lgr5和p53表达量之间的联系。通过流式细胞仪检测阿霉素(0μg/ml或1μg/ml)处理后的稳转Lgr5的肝癌细胞与稳转sh RNA-Lgr5的肝癌细胞的细胞凋亡情况。最后用Western blot检测阿霉素(0μg/ml或1μg/ml)处理后的稳转Lgr5的肝癌细胞与稳转sh RNA-Lgr5的肝癌细胞的凋亡相关蛋白质水平的改变。结果:Lgr5和PDCD5的过表达不能影响彼此之间的表达量。Lgr5的敲除不能影响PDCD5的表达。Lgr5可以竞争性结合PDCD5从而阻遏PDCD5入核。在Lgr5过表达时与p53相互结合的PDCD5明显减少。在肝癌组织中Lgr5和p53之间的存在显著的负相关(P<0.01)。阿霉素可以促进肿瘤细胞的凋亡,而Lgr5可以抑制阿霉素诱导的细胞凋亡。阿霉素可以提高PARP1剪切体与p53的蛋白水平以及改变p53介导凋亡相关蛋白的表达量(Bax的蛋白水平升高而Bcl2的蛋白水平下降)。同时Lgr5的过表达可以减少p53与Bax的表达水平以及提高Bcl2的表达量。结论:Lgr5可以通过竞争性结合PDCD5继而调控PDCD5/p53通路,进而促进肝癌细胞对化疗的耐药。