PRRS RT-qPCR检测试剂盒的研制及其应用

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hzwn001
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)引起猪的一种高度传染性疾病。以母猪发热、厌食、流产、死胎、产木乃伊胎和弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征,给全球养猪业造成相当严重的经济损失,目前对于本病尚无有效的药物进行治疗,主要依靠疫苗预防接种。主要研究内容如下:   设计并合成一对特异性引物及特异探针序列,通过从病料中提取总RNA并逆转录为cDNA,PCR扩增,产物纯化后与pGEM-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选后得到重组标准品质粒,作为模板,且对反应的退火温度、引物浓度等条件进行优化,然建立了一种能够快速、灵敏地检测PRRSV的实时荧光定量PCR诊断方法。结果显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系,线性范围广,17~36个循环都能测出。用该方法对进出口猪40批232份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可以应用于检验检疫工作。并于2007年成功研制出相应的诊断试剂盒。   本研究以Genbank已公布的CSFV、PRRSV、PRV三种病毒的基因序列,分别选择CSFV的NS基因、PRRSV的N蛋白基因、PRV的gE基因序列为模板,设计6对引物用于比较分析,每种病毒挑选出一对特异性引物;克隆鉴定了3种病毒的阳性质粒,构建质粒参比品;针对这个基因片段设计12条相应的寡核苷酸探针进行特异性的检测,筛选出3条灵敏度高、特异性强的探针点样,用于制备基因芯片。   初步探索建立了猪病毒病基因芯片的检测技术,具有良好的特异性和重复性,同时可以实现一张玻片对多个病原菌的检测,具有高通量、快速、简洁的特点,为进出境猪病毒病检验检疫提供技术储备。
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