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白叶枯病是水稻最严重细菌性病害之一,每年造成严重的产量损失。而目前,对白叶枯病的防治,尚未有行之有效的措施,因此,发掘高抗白叶枯病的水稻野生近缘种,并从中克隆和利用高抗白叶枯病相关基因具有重要的意义。
疣粒野生稻(O.granulata Baill)是分布在我国的三种野生稻之一,生长于云南省的热带地区和海南省西南部。云南具有丰富的疣粒野生稻遗传资源,研究发现一些云南疣粒野生稻材料对接种过的各种白叶枯病病原菌都高抗,个别材料达到免疫。研究还发现云南疣粒野生稻并无Xa21、Xa1基因,可能带有目前尚未分离到的广谱高抗白叶枯病新基因。那么疣粒野生稻究竟具有什么抗白叶枯病基因,是组成型还是诱导型,有哪些基因与抗病密切相关等尚缺乏研究。
本研究应用抑制性消减杂交(SSH)技术,以云南景洪疣粒野生稻孕穗期接种处理及非处理为材料,建立白叶枯病菌诱导的叶片SSH文库。文库共得到1002个克隆,996个白斑,重组率为99.4%,平均插入片段长500bp。
从SSH文库中随机挑取288个阳性克隆进行测序,在GcnBank中经BLAST比对分析,获得31个EST可能与植物的抗病性相关,包括3个抗病类似物,3个抵御病原菌的效应物,4个信号转导相关蛋白,11个重要次生代谢相关酶类,4个蛋白降解及其他水解酶类,3个细胞膜、细胞壁的修复和加固相关的酶或蛋白和3个ROS清除酶类。9个EST与植物抗逆应答有关,包括耐旱、耐低温、抗冻、耐盐等;12个EST涉及RNA加工、蛋白质的翻译与加工,25个EST涉及光合作用、能量代谢;15个EST在GenBank中找到了同源性序列,但是其功能尚不清除;13个序列在GenBank中没有发现任何重要的同源性,可能代表了新的基因,或变异较高的cDNA非编码区。
对ME257(STK类)、ME281(NBS-LRR类)进行RT-PCR检测,从而结果证明ME257和ME281是诱导型特异表达,与抗病直接相关。据此推测这三个基因在抗病过程中可能起不同的作用。
此研究通过构建SSH文库,初步鉴定了疣粒野生稻在孕穗期受白叶枯病菌胁迫诱导的基因表达情况,为从分子水平认识疣粒野生稻高抗白叶枯病机制奠定基础,同时为从疣粒野生稻中克隆和利用高抗白叶枯病基因提供理论依据。