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目的： 采用大脑中动脉阻断大鼠模型和体外细胞缺氧缺糖模型。探讨 miR-155 和Rheb/mTOR通路在缺血性脑卒中发生中的作用；研究miR-155和Rheb/mTOR通路在缺血性脑卒中发生中的交互作用。 方法： 研究采用大脑中动脉阻断大鼠模型和体外细胞缺氧缺糖模型模拟缺血性脑卒中发作。分别应用miR-155 mimics、miR-155 inhibitors和Rheb siRNA以改变miR-155和Rheb的表达水平。采用TTC染色测定脑梗塞范围；使用annexin V-FITC / PI标记和流式细胞仪测定细胞凋亡；采用 RT-PCR、免疫荧光和免疫印迹杂交测定miR-155、Rheb、mTOR、S6K和p-S6K表达水平。利用荧光素酶活性测定评估miR-155和Rheb之间的关联。 1. 动物模型中慢病毒转染：建立SD大鼠大脑中动脉阻断（MCAO）模型。两组片段分别包含miR-155 mimics和miR-155 inhibitors装载入pCDH载体。将相应pCDH载体等一起转染大鼠，转染后48小时收集。分别将慢病毒构建物（阴性对照、miR-155 mimics和miR-155 inhibitors）在MCAO手术前24小时注入大鼠侧脑室。48只大鼠随机分为4组：对照组（12只大鼠，进行假手术和阴性对照注射）；模型组（12只大鼠，进行MCAO手术和阴性对照注射）；miR-155模拟组（12只大鼠，进行MCAO手术和 miR-155 mimics 注射）；miR-155 抑制剂组（12 只大鼠，进行MCAO手术和miR-155 inhibitors注射）。 2. 动物模型中用TTC染色评估脑梗塞情况：组织切片置于2％的TTC染液中，在37℃黑暗条件下染色20分钟，然后将切片固定于4％多聚甲醛磷酸缓冲液中1小时。脑梗塞比率计算方法：梗塞体积/总体积。 3. 动物模型的免疫荧光：将大鼠脑组织速冻、切片，先与初级抗体Rheb孵育，再与第二抗体辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG孵育。切片经水合、洗涤，用二氨基联苯胺染色，显微镜下进行结果观察。 4. 细胞培养：BV2细胞在用Dulbecco改良的Eagle培养基中培养，加入谷氨酰胺、青霉素、链霉素和10％小牛血清。培养条件为37℃、5％CO2。 5. BV2细胞缺氧缺糖（OGD）模型建立：对照组中，BV2细胞在DMEM中培养，常氧条件（21％O2和5％CO2）并加入4.5g/mL葡萄糖。OGD模型中，BV2细胞在DMEM培养基中培养，低氧条件（5％CO2和95％N2）且培养基中未加入葡萄糖或血清。 6. 细胞转染：使用脂质体2000转染BV2细胞。转染后24小时，按照对照组和OGD模型组细胞的上述控制条件再培养4小时。然后，分别用不同载体转染细胞。并将细胞在对照组和OGD模型组特定条件下培养。将BV2细胞分为5组：对照组（对照组条件下和特定空质粒转染细胞）；OGD组（OGD条件下和特定空质粒转染细胞）；miR-155模拟物组（OGD条件下和miR-155 mimics转染细胞）；miR-155抑制剂组（OGD条件下和miR-155 inhibitors转染细胞）；miR-155抑制剂+Rheb siRNA组（OGD条件下，miR-155 inhibitors+Rheb-siRNA转染细胞）。 7. 细胞凋亡检测：采用凋亡检测试剂盒，Annexin V-FITC/PI标记和流式细胞仪测定细胞凋亡。 8. 荧光素酶活性检测：PCR 扩增 Rheb 的 3 UTR。将该 PCR 产物克隆到psiCHECK-2荧光素酶载体。采用Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System突变相应结合位点。48孔板中培养BV2细胞，然后将不同载体转染入细胞：一组用200ng pGL3，10ng pRL-TK载体和miR-155载体；另一组为200ng pGL3，10ng pRL-TK载体和阴性对照载体。转染48小时后对转染细胞进行分析。 9. RNA提取和RT-PCR：使用TRIzol试剂分别从脑组织和BV2细胞中分别提取总RNA。总RNA用ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒转录成cDNA。然后，使用SYBR?qPCR Mix和CFX96实时PCR检测系统进行RT-PCR。用GAPDH对目标基因的表达水平进行标准化，使用2-ΔΔCT方法量化靶基因表达。 10. 免疫印迹杂交检测：采用 RIPA 缓冲液裂解组织和细胞来提取蛋白，用Bradford法给总蛋白量定量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离完成后，将蛋白印迹条带转移到PVDF膜上。将膜封闭在含5％脱脂乳TBST中，封闭1小时后，分别与Rheb、mTOR、S6K和pS6K一抗进行孵育。然后将PVDF膜与二抗结合。最后用增强的化学发光剂给蛋白条带显影定影，通过软件进行结果分析。 结果： 1. TTC染色结果：大鼠MCAO模型中采用TTC染色法测定脑梗塞范围。模型组较对照组出现更大范围的脑梗塞（t=21.725，P<0.01），miR-155 模拟物组较其余三组出现更大范围的脑梗塞（F=89.221，P<0.01）。然而，miR-155抑制剂组较模型组出现脑梗塞范围减少（t=9.518，P<0.01）。 2. 动物模型中Rheb表达：免疫荧光结果显示在模型组和miR-155模拟物组中Rheb阳性区域低于对照组。miR-155抑制剂组与模型组、miR-155模拟物组相比均显示了Rheb的高表达。 3. 大鼠模型中miR -155、Rheb和mTOR的表达：模型组中miR-155表达水平较对照组升高（t=22.088，P<0.01），与模型组相比，miR-155 模拟物转染后上调miR-155的表达（t=9.745，P<0.01）。miR-155抑制剂组与模型组、miR-155模拟物组相比，miR-155的表达降低（F=68.809，P<0.01）。但是，与对照组相比，miR-155抑制剂组miR-155表达水平是增高的（t=13.723，P<0.01）。动物模型建立和miR-155转染对Rheb和mTOR的表达影响有类似结果。模型组中Rheb（t=19.804，P<0.01）和mTOR（t=16.001，P<0.01）的表达低于对照组，四个不同组别之间miR-155模拟物组显示最低水平的Rheb（F=63.090，P<0.01）和mTOR（F=59.121，P<0.01）表达。与模型组和 miR-155 模拟物组相比，miR-155 抑制剂转染后可显著上调 Rheb （F=61.077，P<0.01）和 mTOR（F=73.321，P<0.01）的表达水平，但仍低于对照组中Rheb（t=6.590，P<0.01）和mTOR（t=6.490，P<0.01）的表达。 4. miR-155结合Rheb-3UTR抑制了Rheb的表达：Rheb的3-UTR有一个高度保守的miR-155结合位点。BV2细胞中，miR-155与Rheb内源性3-UTR结合抑制了荧光素酶活性（t=22.960，P<0.01）。然而，miR-155 空载和阴性对照组中荧光素酶活性差异无统计学差异（t=0.739，P=0.468）。同样，阴性对照组和突变组相比荧光素酶活性差异无统计学差异（t=1.829，P=0.081）。 5. miR-155和Rheb对BV2细胞凋亡的影响：annexin V-FITC/PI标记和流式细胞仪测定细胞凋亡结果显示：对照组细胞凋亡率最低，而miR-155模拟物组细胞凋亡率最高（F=48.572，P<0.01）。且与对照组相比，OGD 模型诱导细胞凋亡率增加（t=19.727，P<0.01）。与OGD组和miR-155模拟物组相比，miR-155抑制剂组细胞凋亡率降低（F=85.502，P<0.01）。与miR-155抑制剂组相比，在miR-155抑制剂组中导入Rheb siRNA后又增加了细胞凋亡率（t=5.438，P<0.01），差异具有统计学意义。 6. BV2细胞中miR-155、Rheb和mTOR的表达：在BV2细胞，OGD组的miR-155表达较对照组增高（t=30.471，P<0.01），与OGD组相比，miR-155模拟物组miR-155表达水平更高（t=5.101，P<0.01）。与OGD组相比，miR-155抑制剂转染后减低了miR-155的表达水平（t=18.004、P<0.01）。在miR-155抑制剂中导入Rheb-siRNA后对miR-155的表达水平并无明显影响（t=0.328，P=0.746）。与对照组相比，OGD组中显示Rheb（t=19.236，P<0.01）和mTOR（t=26.827，P<0.01）的低表达，其余四组中miR-155模拟物组显示Rheb（F=118.556，P<0.01）和mTOR（F=121.198，P<0.01）表达水平最低。与OGD组和miR-155模拟物组相比，miR-155抑制剂转染后能够上调Rheb（F=112.664，P<0.01）和mTOR（F=129.963，P<0.01）的表达。与miR-155抑制剂组相比，在 miR-155 抑制剂组中同时导入 Rheb-siRNA 又抑制了 Rheb （t=14.263，P<0.01）和mTOR（t=7.889，P<0.01）的表达。 7. 大鼠动物模型miR-155对S6K和p-S6K表达的影响：使用免疫印迹杂交分别检测动物模型中S6K和p-S6K的表达水平。与对照组相比，模型组中S6K表达水平减低（t=7.091，P<0.01）。miR-155抑制剂组中 S6K表达高于miR-155模拟物组（t=4.430，P<0.01）。模型组与miR-155模拟物组相比S6K表达差异无统计学意义（t=1.343，P=0.166）。模型组与miR-155抑制剂组相比S6K表达差异无统计学意义（t=1.963，P=0.062）。模型组和对照组相比p-S6K表达水平（t=15.817，P<0.01）和p-S6K/ S6K比值（t=29.053，P<0.01）均降低。并且，miR-155模拟物组较模型组p-S6K表达更低（t=5.472，P<0.01），而与模型组和miR-155模拟物组相比，miR-155抑制剂组中p-S6K表达水平（F=74.196，P<0.01）和p-S6K/S6K比值（t=125.721， P<0.01）均增加。 8. BV2细胞miR-155对S6K和p-S6K表达的影响：使用免疫印迹杂交分别检测BV2细胞中S6K和p-S6K的表达水平。缺氧和miR-155的转染影响S6K的表达水平。与对照组相比，OGD组中S6K表达水平较低（t=4.768，P<0.01）。与对照组相比，miR-155模拟物组中 S6K表达水平减低（t=7.984，P<0.01）。与 miR-155模拟物组相比，miR-155抑制剂组显示了较高的S6K表达水平（t=6.200，均P<0.01）。与对照组相比，OGD 组中 p-S6K（t=19.235，P<0.01）表达和 p-S6K/ S6K 比值（t=14.653，P<0.01）均减低。与miR-155模拟物组相比，miR-155抑制剂组显示较高的p-S6K表达水平（t=18.402，P<0.01）。miR-155抑制剂+Rheb siRNA组中p-S6K表达和p-S6K/S6K比值均低于miR-155抑制剂组（t=8.066、9.628，均P<0.01），但高于OGD组（t=5.191、6.209，均P<0.01）。 结论： 1. 大鼠MCAO模型和BV2细胞OGD模型中均有miR-155表达增高，相反， Rheb、mTOR和p-S6K的表达水平是降低的。 2. miR-155抑制剂转染后抑制了miR-155的表达，而Rheb和mTOR的表达是上调的，这在缺血性脑卒中表现为动物模型中显示脑梗塞范围减少和体外培养BV2细胞凋亡减少。 3. miR-155与Rheb 3’ UTR结合可抑制Rheb的表达，用siRNA干扰Rheb表达后这一作用是被削弱的。 4. 在缺血性卒中发病过程中，抑制miR-155通过Rheb/mTOR信号通路发挥了保护性作用，这一保护性作用可能通过磷酸化S6K从而激活Rheb/mTOR下游通路实现。