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第一部分,HGV作为复制型基因治疗载体的实验研究.庚型肝炎病毒(hepatitis G virus,HGV)是单正链的RNA病毒,长约9.4Kb,含一个开放读码框架,编码2900左右的氨基酸.病毒具有细胞亲嗜性,分别存在着淋巴细胞和肝细胞亲嗜株,该室建立的HGV克隆株经初步实验证实其可能是肝细胞亲嗜性的.HGV与HCV同属于黄病毒家族,其基因组结构和复制机理也非常相似.用外源基因neo代替HCV的结构基因区,并插入ECMVIRES直接翻译HCV的非结构基因区,由此建立的HCV亚基因组复制子能够在体外培养细胞中自主持久复制和表达.因此,我们尝试将HGV基因组进行适当改造,用外源报告基因或治疗基因代替HGV的结构基因,并插入筛选标志抗性基因neo,两者间直接用ECMVIRES连接,保留HGV的非结构基因,由此建立HGV亚基因组复制子,研究其在稳定表达HGV结构蛋白的体外培养细胞中的复制、表达和病毒的包装,探索将病毒构建成能自主复制并且具有肝组织靶向性的一类新型载体,以期用于肝病的基因治疗.第二部分,小干扰RNA对庚型肝炎病毒表达复制抑制作用的研究.RNA干扰(RNAi)是由小干扰RNA(siRNA)引发的生物细胞内同源基因的转录后基因沉默现象,是近年来兴起的一项研究生物基因调控与功能的崭新技术,是机体抵御外在感染的一种重要保护机制,是一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具.其本质是siRNA与其对应的靶mRNA特异结合,降解靶RNA从而阻止其转录后的翻译.siRNA是双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)被RNase Ⅲ家族中的核酸酶Dicer降解后产生的长21-23个核苷酸(nucleotide,nt)的小片段,具有5′-磷酸、3′-羟基和1-2nt的3′-粘性末端.该课题设计了靶向HGV E2区的两对siRNA,研究siRNA对HGV病毒RNA合成和基因表达的抑制作用,探讨RNAi在阻断病毒复制方面的应用.实验还同时设计了靶向报告基因EGFP的一个已知有效的siRNA作为阳性对照,设计一个与人、小鼠、大鼠等基因无任何同源性的无关siRNA作为阴性对照.综上所述,该研究中采用全长HGV结构基因包括5′NTR区构建了表达载体,转染Huh7细胞证实其能成功表达和剪切、修饰,提示建立的HuhEH细胞株可能可以作为HGV基因治疗载体的包装细胞.构建了同时带有报告基因与筛选基因或是治疗基因与筛选基因的HGV亚基因组复制子,并在体外培养细胞Huh7中证实此复制子是能够自主持久表达和复制的,并在培养上清中检测到了HGV复制子RNA的存在,电镜下检测到了可疑病毒样颗粒,提示将HGV改造成基因治疗载体是可行的.该研究第二部分建立了一个行之有效地衡量RNAi效应的阳性对照系统(Huh7-N/EGFP siRNA).证实两对HGV特异性E2 siRNA可以有效的特异性抑制HGV基因的表达和病毒的复制,提示RNAi可以作为有效的抑制病毒复制与感染的手段.