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近十年来,表观遗传学的研究飞速发展,并已成为研究前沿和国际热点,该领域研究表明染色质水平和核水平的调控是真核基因表达调控的重要方式。在染色质水平,DNA通过组蛋白包装成核小体进而组装成30nm染色质的过程,能够对真核基因表达产生复杂的调控作用。一方面,核小体中组蛋白的修饰和修饰的组合及核小体结构重塑,能够调节顺式元件的可接近性,来调控基因表达开关。另一方面,可以通过形成染色质环状结构域(chromatin loop domain,CLD),来介导远端调控元件和启动子区接触,或者隔离子元件的相互作用,从而达到调控基因表达的目的。
近年由于染色质构象捕获(chromosome conformation capture,3C)及其全基因组高通量衍生技术的发展发现了大量染色质远距离相互作用和染色体间相互作用。研究表明,这些长距离染色质相互作用能够促进一维序列上远离的顺式元件和靶基因启动子的相互靠近,或者形成隔离子等功能性结构,参与基因表达调控。尤其在成簇基因表达调控方面,高级染色质构象更扮演重要角色,包括Igf/H19(Murrell et al.,2004a),beta-globin(Palstra et al.,2008),T helper type2 cytokine(Spilianakis and Flavell,2004),MHC classⅠ(Kumar et al.,2007)和MHC classⅡ(Maiumder et al.,2008)等基因簇。
越来越多的证据表明染色质高级构象参与基因转录调控,那么研究染色质高级构象是如何形成和被调控的,有助于我们理解染色质高级构象和基因转录调控之间的关系以及真核生物细胞核是如何有序有功能分区地组装在一起的。CTCF(CCCTC-binding factor)是组装染色质高级构象并参与基因转录调控的重要分子。CTCF在进化中保守性很高,其锌指结构域氨基酸序列在脊椎动物中几乎完全保守。哺乳动物中CTCF在精母细胞以外的组织中泛在表达,其保守性和表达的广泛性也提示了该分子的重要作用。CTCF参与多种细胞生物学过程,包括生长、增殖、分化、凋亡、隔离子和绝缘子形成以及遗传印迹和X染色体失活等过程。目前研究认为CTCF主要依靠其形成染色质高级构象和染色质环的功能来发挥抑制、激活或绝缘等对基因表达的调控功能。高通量研究表明CTCF是细胞核内全基因组3D结构的组织者(master weaver of the genome)(Phillips and Corces,2009)。
HOX基因因其在发育过程的体节模式形成中的重要作用,且在脊椎动物中呈现严格的时空共线性表达的特征,而受到研究者的关注。表达的先后顺序和其在染色质上的排列顺序高度一致这一时间共线性表达特征对于HOX基因发挥正确的功能非常重要。这种精细的和协调配合的表达模式表明脊椎动物中HOX基因簇基因受到非常严格的共调控。研究者也致力于解答HOX基因簇共线性调控的机制。我们在人HOXA基因簇中检索到9个保守的CTCF结合位点,考虑到CTCF是介导染色质高级构象的重要蛋白,于是我们以CTCF和染色质高级构象作为切入点,研究共线性表达的分子机制。
在本研究中,我们首先建立了RA诱导NT2/D1细胞HOXA基因簇共线性表达的模型,继而实验确定了NT2/D1细胞中HOXA基因簇上CTCF和cohesin蛋白RAD21的结合和随RA诱导的变化,以及HOXA基因簇染色质高级构象和伴随RA诱导的的变化。我们利用RNAi技术在NT2/D1细胞中敲低CTCF表达,研究了其对HOXA基因簇基因表达、对组蛋白修饰以及对染色质空间构象的影响,并根据实验结果和国际进展对CTCF蛋白调控基因簇的模式进行了一定的探讨。最后,我们在来源于体轴前后不同位置的原代成纤维细胞和293T细胞中检测HOXA基因簇基因表达、簇内CTCF/cohesin结合和HOXA基因簇染色质高级构象,探讨三者关系；并通过在293T细胞中过表达和干扰CTCF,验证CTCF对HOXA基因簇基因的调控作用。我们发现CTCF通过介导人HOXA基因簇形成凝缩的染色质高级构象,促进PcG发挥抑制功能,控制HOXA基因共线性表达。我们的实验结果显示CTCF对HOXA基因表达的控制机制不仅仅在人畸胎瘤细胞系NT2/D1中适用,而且在来源于体轴不同位置的原代成纤维细胞中,以及293T细胞中也存在相似的作用机制。我们认为CTCF通过介导染色质片段间相互作用,形成凝缩的染色质高级结构,来促进抑制具有一定的普适性。本研究为进一步理解共线性的调控机制,染色质高级构象如何调节基因表达以及CTCF参与核组织和转录调控的分子机制等问题提供了理论参考。