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花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物。近年来,我国食用花生的比例逐年增加,消费者对保健花生品种,特别是对富含花青素含量较高的红或黑种皮花生品种的需求日益增加,但由于目前国内外对控制花生种皮颜色的相关基因和分子机制尚未清晰,导致富含花青素品种选育进展缓慢。针对这一现状,本论文以不同种皮颜色的4个花生品种(金花39、粤油7号、珍珠红、珍珠黑)为材料,采用高效液相色谱(HPLC),实时荧光定量PCR,基因克隆等方法,比较分析4个不同种皮颜色的花生品种中花青素含量的差异,并基于植物花青素生物合成途径,比较分析与花青素合成相关的7个基因在不同种皮颜色花生品种中的结构和表达差异,以期挖掘出控制花生种皮颜色的相关基因,阐明色素形成的分子机理。本研究为下一步培育富含花青素花生品种打下理论基础。
此外,鉴于目前国内外花生遗传转化率较偏低,转化体系不成熟,本论文对现有的转化体系进行优化研究,以期为建立一个花生高效遗传转化体系打下基础。
本研究主要研究结果:
1、采用HPLC,对4个不同颜色花生品种种皮成分进行鉴定与检测,结果表明,花生种皮颜色主要是由飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素三种色素组成,花青素含量与花生种皮颜色的深浅成正相关,不同种皮颜色品种中花青素的种类和含量存在很大差异,其中飞燕草色素在珍珠黑品种中含量最高。
2、基于植物花青素生物合成途径,采用RACE方法克隆7个与花青素合成相关基因全长,并比较其全长cDNA序列在4个不同颜色花生品种中的差异:结果表明:除苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)外,查耳酮合成酶基因(CHS);查耳酮异构酶基因(CHI)；二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)；类黄酮-3羟化酶基因(F3H)；花色苷合成酶基因(ANS)；类黄酮3-O-糖基转移酶基因(3GT)等6个基因序列在4个花生品种中均存在氨基酸替换的现象。其中CHS基因在4个花生品种中存在8个氨基酸位点的差异,CHI基因存在1个氨基酸位点的差异,DFR基因存在1个氨基酸位点的差异,F3’H基因存在12个氨基酸位点的差异,ANS基因存在1个氨基酸位点的差异,3GT基因存在9个氨基酸位点的差异。但这些差异均未发生在保守位点,这些基因的结构差异是否与花生种皮颜色差异相关还有待进一步探讨。同时,对这些基因进行的生物信息学分析显示:上述基因编码的氨基酸序列与其它物种同源基因相比一致性较高；在氨基酸序列上具有重要的酶活性位点和保守的功能结构域。
3、采用实时荧光定量PCR技术研究苯丙氨酸解氨酶基因(PAL);查耳酮合成酶基因(CHS)；查耳酮异构酶基因(CHI);二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR);类黄酮-3羟化酶基因(F3H)；花色苷合成酶基因(ANS)；类黄酮3-O-糖基转移酶基因(3GT)等7个花青素合成途径相关基因在4个不同颜色花生品种5个发育时期的转录水平,结果显示:7个基因在荚果发育的第三或第四时期表达量最高,其中CHS,CHI,F3H,DFR,3GT及ANS的转录水平稳定升高,种子成熟后,所有转录物的水平均降低,特别是在珍珠黑和珍珠红这2个品种中表现尤为显著。其中,PAL和3GT基因表达水平均不高；CHS基因和CHI基因在珍珠黑品种的第三时期中表达水平最高,DFR基因和F3H基因在深颜色种皮,尤其是珍珠黑品种中高表达；与其他6个基因不同的是,ANS基因仅在珍珠黑品种中显著高表达,且为7个基因中最高的表达水平。这些基因表达水平的差异与花生种皮颜色差异呈正相关,推测可能是导致花生种皮颜色差异的主要原因。
4、对花生遗传转化体系进行优化研究,结果表明:(1)在以以农杆菌介导转化体系中。以带花原基的子叶为外植体,在OD600为0.7的菌液中,加入150 mg/L的MES,40Kpa真空处理10min,共培养3d后进行二次侵染,可显著提高遗传转化率,GUS基因阳性表达率最高,达73.3％。(2)在基因枪介导转化体系中,当轰击次数为2次,轰击距离为9cm时,其转化率和存活率最好,为44.4％,但均低于农杆菌介导转化体系。