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如今,由于抗生素的滥用,不可避免地导致耐药微生物的产生,对人类自身生存和发展产生很大的威胁。而解决病原菌耐药性问题的一个有效途径就是研制出与传统抗生素作用机制不同的新型抗菌药。而抗菌肽的出现,无疑为陷入困境的抗感染治疗带来了曙光。抗菌肽(antibacterial peptide,AMPs)是生物体产生的一种阳离子小肽,广泛地存在于自然界中,多数具有广谱杭菌活性,是生物先天性免疫的重要组成成份.由于其独特的抗菌机制,不容易诱发细菌的耐药性,成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。从两栖动物叶水蛙(Phyllomedusa distincta)的皮肤分泌物中分离获得的抗菌肽Dermadistinctin-L (DDL)、Dermadistinctin-K (DDK)都属于皮抑菌肽家族。天然分离的抗菌肽DDK和DDL其各自在较低的浓度下就可以对多种细菌显示出抑菌活性,尤其对耐药性的金黄色葡萄球菌表现出有效抗菌能力,在耐抗生素病原菌株大量涌现的今天,抗菌肽DDK和DDL具备发展成为新型抗菌药物的潜在条件。但有关Dermadistinctin家族抗菌肽基因工程应用研究方面尚未有报道。本研究目的就是应用基因工程和蛋白质工程技术研制出重组抗菌肽DDK和DDL,并研究其体内外抗菌活性,为重组抗菌肽的工程化生产及其在临床上的应用奠定基础。本研究主要从以下几个方面展开：1选取Genbank中的Dermadistinctin抗菌肽基因序列,并根据大肠杆菌偏嗜密码子设计并采用重叠区PCR法(SOE)人工合成抗菌肽DDK和DDL全基因,全长分别为148 bp和121bp。在抗菌肽基因的两端引入肠激酶酶切位点,便于表达后的酶切,保证酶切后具有抗菌肽的天然活性结构。2 PCR扩增出DDK和DDL的基因片段,分别利用HindⅢ和XhoⅠ、HindⅢ和SacⅠ限制性酶切位点将基因片段依次连接到pET32a(+)原核表达载体中。将初步酶切鉴定阳性的质粒测序,验证得到基因序列完全正确的克隆。再将正确的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态菌株中,用IPTG初步诱导表达,初步确定Dermadistinctin重组串联表达蛋白可以正常表达且具有较高表达量。3通过调整诱导时间,诱导剂剂量等方法优化Dermadistinctin重组串联融合蛋白的表达条件。确定诱导4小时,IPTG终浓度0.1mM为Dermadistinctin重组串联融合蛋白的最佳表达条件。并以此条件为基础转为大量诱导表达,将大量诱导表达的Dermadistinctin重组串联融合蛋白经Ni亲和层析纯化得到纯化的Dermadistinctin重组串联融合蛋白。4将纯化的Dermadistinctin重组串联融合蛋白进行肠激酶酶切,去掉抗菌肽两端的保护性氨基酸恢复其天然活性结构。用MIC和MBC方法检测肠激酶切割的重组抗菌肽对大肠杆菌(Escherichia coil DH5a)、鸡致病性大肠杆菌(Escherichia coil O1)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、猪链球菌2型(Streptococcus suis 2)、马链球菌兽医亚种(streptococcus equi subsp)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)等细菌的抑菌杀菌效果；且在不同剂量、不同pH值、不同温度下对大肠杆菌(Escherichia coil DH5a)抑菌活性的酸碱稳定性和温度稳定性；重组抗菌肽在不同浓度下对小鼠红细胞的溶血活性。试验结果显示：重组抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑制作用；在pH7.0时重组抗菌肽蛋白具有最佳抗菌活性,PH值6.0-8.0之间的环境抑菌力较好且稳定；虽然重组抗菌肽在100℃沸水中处理30min抗菌活性有所下降,但是依然可以保持抗菌活性；且重组抗菌肽几乎不表现出溶血活性；基于这样的特性该重组抗菌肽可能有在饲料和替抗药物中应用的潜力。5在体外活性实验的基础上,进行重组抗菌肽DDK和DDL混剂对小鼠的体内保护实验。预防实验组结果显示重组抗菌肽DDK和DDL混剂对致病性大肠杆菌的感染具有良好的预防作用。