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程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）,又称为CD274,B7-H1,是由9号染色体上的cd274基因编码的,并由干扰素调节性因子（IRF1）,信号传导转录激活因子1（STAT1）反应原件及其启动子所调控。抑制性受体PD-1（CD279）通过与其配体PD-L1和PD-L2（B7-DC,CD273）的结合,免疫应答的减弱和外周耐受性的维持程度被极大地增强。PD-L1与其受体B7.1（CD80）和PD-1的相互作用可以抑制T细胞增殖,迁移和细胞毒性介质的分泌。活化的T细胞和B细胞能表达PD-1,而PD-L1也可以通过炎性细胞因子在巨噬细胞和树突状细胞上诱导。PD-1/PD-L1（B7-H1）表达在肿瘤细胞上,而在大部分的正常细胞上不表达。免疫因子干扰素γ（IFN-γ）可显著诱导PD-L1的表达,并可用于通过抗PD-L1治疗的免疫疗法。抗PD-L1疗法在肿瘤微环境中是高度有效的。尽管PD-L2与PD-1的结合表现出与PD-L1类似的结合亲和力,但由于PD-L2在肿瘤细胞上的表达有限,并且大置存在于树突细胞上限制了其对肿瘤细胞的作用。PD-L1/PD-1疗法表明了主要途径并为免疫缺陷提供了新的疗法。B7家族成员之间的相互作用会降低T细胞活化的水平,主要通过减少白细胞介素-10、IL-4和IL-2分泌和通过PD-1受体缔合的IFN-γ产生来起作用的。免疫抑制正在成为现今各种免疫疗法当中的有效治疗选择。早期的免疫疗法包括局部免疫注射卡介苗（BCG）、癌症疫苗、炎性细胞因子、免疫检查抑制剂和直接细胞疗法的注射。迄今为止,这些免疫治疗药物的疗效有限,而且会出现毒性反应;因此,现如今迫切需要研发科特异性激活免疫系统来对抗肿瘤细胞的药剂。但这种免疫抑制的药剂,产生耐药性和复发是最常见的障碍。通过抗炎细胞因子下调免疫系统通常会抑制抗肿瘤细胞的增殖和移动。免疫抑制的耐药机制的关键是T细胞抑制性受体的表达上调。基于抗体的免疫疗法在癌症研究中发挥关键作用,在肿瘤抑制方面取得了有效的成果。肿瘤通过调节免疫检查途径来得以存活,以维持免疫细胞和癌细胞环境之间的不平衡。免疫细胞和癌细胞的相互作用会导致T细胞抑制信号的产生和对各种肿瘤细胞的增殖。PD-L1已经产生了用于阻断PD-L1/PD-1相互作用的抗体开发的新的靶点。本论文实验完成了 PD-L1细胞外结构域的优化,进一步利用噬菌体展示技术成功筛选出抗PD-L1的单链抗体可变区片段（scFv）。选择高亲和力的克隆并在细菌宿主中成功表达。纯化的蛋白质被加工用于抗体偶联药物（ADC）的研究和全抗体生产。针对不同癌细胞系对优化的scFv-PD-L1药物缀合物活性及其细胞内运输进行了研究。全长抗体基因转染进CHO细胞并且在无血清培养基中成功表达,并将得到的全长抗体检测其在PD-L1阳性细胞中的表面结合亲和力。这些重组分子将可以用于抗PD-L1癌症治疗和生物治疗剂的深入研究。方法PD-L1基因在国家生物技术信息中心和欧洲生物信息学研究所数据库是使用人类分类学鉴定号9606,在NCBI中的参考序列是NM014143.2和NM04143.3,PD-L1胞外结构域（PDL1-ECD）的检索号是Q9NZQ7。编码PDL1-ECD的基因片段通过特定引物进行扩增,引物两端加入EcoR1和XhoI限制酶切位点以便于进行酶切。PCR扩增产物连接到pMD18-T克隆载体上形成重组克隆载体pMD18-T/PDL1-ECD,然后将限制性酶切产物连接到pET30（+）载体中,并将重组载体pET30（+）/PDL1-ECD克隆到大肠杆菌BL21（DE3）中,表达重组蛋白。阳性转化菌BL21（DE3）生长至对数生长期（OD600=0.4-0.6）时,加入终浓度为1 mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）,并分别在37℃,30℃,28℃,和16℃条件下培养5 h后收集。收集到的细菌通过裂解和超声,并经Ni-NTA柱亲和层析纯化,PBS缓冲液透析。得到的PD-L1重组蛋白通过噬菌体展示技术筛选获得scFv-PD-L1抗体。M13KO7辅助噬菌体（1.47×1012）转染大肠杆菌TG1,并通过在37 ℃的2YT培养基中孵育16 h进一步富集,用20%PEG/2.5 M NaCl溶液进行浓缩,最后离心收集。Ni-NTA树脂经0.5 M NaCl洗涤后加入300 μg/ml的PD-L1蛋白,使其与树脂结合。加入5%BSA封闭1 h,随后在封闭缓冲液中加入扩增的噬菌体孵育2 h,然后用TBST洗涤5次。特异结合的噬菌体依次用洗脱缓冲液（200 mM 咪唑,0.5 M NaCl,0.1 M PBS）和 0.2 M 甘氨酸-HCl（pH 1.7）处理洗脱。洗脱液用Tris-HCl（pH 9.0）调节pH值并进行过滤。洗脱的噬菌体转染进TG1进行选择,并铺板于含100 μg/ml氨苄青霉素的2YT琼脂平板上。将阳性克隆接种到液体培养基中并在37℃孵育,随后加入浓度为1010的辅助噬菌体进行侵染。培养16 h后收集菌液,PD-L1阳性的scFv克隆可用PEG/NaCl溶液浓缩。重复该过程三次以分离高亲和力的克隆。选取300个阳性克隆用于序列分析和补体确定区域。挑取阳性克隆,进一步用大肠杆菌宿主机制表达,并通过Ni-NTA树脂纯化。用咪唑洗脱蛋白质并用PBS进行透析。洗脱的scFv-PD-L1蛋白的结合亲和力可用ELISA,Western印迹和免疫荧光技术分析测定。利用高亲和力的scFv-PD-L1表达蛋白来制备抗体偶联药物。抗体偶联药物一般包含三种基本组分:抗体、接头和细胞毒性药物。我们使用scFv-PD-L1表达蛋白所携带的重链和轻链可变区作为抗体组分,SMCC作为接头和DM1细胞毒性药物。将20mMSMCC接头和10mMDM1药物分别溶于DMSO中。将20倍SMCC和10倍DM1混合并在20℃温育,然后加入scFv-PD-L1蛋白（1 mg/ml）。混合物随后在37℃温育20 h。将最终的混合物过滤并倒入Sephadex G-25柱中,用PBS以0.5 ml/min的流速洗脱。用Shimadzu-UV-2600分光光度仪分析收集的滤液在250 nm和280 nm波长处的吸光度。噬菌体抗体scFv-PD-L1随后可用于构建全长抗体,重链和轻链可变区可作为扩增模板。设计引物用于扩增和连接可变区片段和信号肽。将EcoRI和NheI限制性酶切位点分别添加到重链片段和信号肽两端,将Bsiw I限制性酶切位点添加到轻链中以助于构建重组子。这些片段通过PCR扩增并连接起来,然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行纯化。将纯化产物用酶消化以产生切口位点。将片段插入pMH3-kH/kL载体以形成嵌合体。将重组载体转移至细菌细胞,通过测序,PCR鉴定和酶消化确认重组子。提取质粒并用Lipofectamine 2000将质粒转染到CHO细胞中。使用G418抗生素筛选阳性克隆。将阳性细胞在96孔板中进行单克隆化以得到单细胞阳性克隆。随后扩大培养至24,12和6孔板。选择高滴度克隆转移至细胞培养瓶中以获得最大抗体表达量。抗体结合亲和力是使用培养上清液用ELISA测定的。表达的抗体通过Protein A纯化,并计算其与PD-L1阳性细胞的结合亲和力。结果实验结果表明,我们构建的pET30（+）/PDL1-ECD系统能有效地产生38.1kD的重组蛋白。原核表达系统为表达PD-L1细胞外蛋白提供了 一种简便的方法,有助于PD-1/PD-L1结合抑制作用的研究和有价值的药物及抗体的制备。蛋白印迹分析结果表明重组表达的PD-L1-ECD能被人抗-PD-L1 IgG识别。结果说明重组纯化蛋白具有生物活性构象,并保持了有效的抗原性,可以进一步用于有效的抗体和治疗药物的制备。噬菌体展示技术结果显示在两次重复的筛选过程中产率都得到提高,分别为4.0×103和3.76×104（富集倍数分别为22.56和1225.27）。有8个不同的克隆被发现有精确的基因组成,其中4个具有相同的基因组成。我们从其中选择了一个和其余四个进行重组蛋白表达。我们成功构建并表达了三种最佳高结合亲和力的克隆,并进行免疫荧光,ELISA和蛋白质印迹技术分析以确认其生物活性。构建的抗体偶联药物通过SDS-PAGE电泳,分光光度法和免疫荧光技术进行鉴定。与未缀合药物的蛋白相比,SDS-PAGE电泳结果显示抗体偶联药物条带的位置略微增加。偶联缀合物使用分光光度法显示有两种不同峰值的吸光度。其中一个单峰显示缀合的药物,而另一个峰显示非共轭的实体。未缀合物的吸光度位于两个不同的位置,以区分未缀合的药物与缀合的药物。我们还分析了抗体偶联药物的胞内运输机制。我们以不同的时间间隔将scFv-PD-L1抗体偶联药物与PD-L1阳性癌细胞系（A549）共同孵育,并发现在孵育2 h时,ADC分子都能聚集在A549细胞表面,这在细胞内研究中可用作有效温育的时间。3 h后A549细胞表面结合信号增加,可能表明内化药物运输回细胞表面。抗PD-L1全长抗体成的功表达及通过ELISA和细胞表面结合相互作用检测了其生物活性。细胞转染和抗体表达均在无血清培养基进行中。单链片段由重链和轻链的可变区组成。这些可变区通过接头连接,可以为重组全长抗体表达提供多样化来源。我们构建了全长抗体,并成功转移到中国仓鼠卵巢（CHO）哺乳动物宿主中进行全长抗体表达。将表达的抗体作用于PD-L1阳性癌细胞进行结合亲和力的测定。阳性信号显示表达抗体具有有效性。结论我们在实验室的小规模的表达纯化中得到了纯度更高,有生物活性成分的重组蛋白。使用大肠杆菌宿主细胞的表达系统为表达重组PD-L1蛋白提供了简单方法,研究重组PD-L1蛋白可用于产生针对癌细胞的抗体和ADC。另外我们研究出一种从人类合成文库中筛选出抗PD-L1的scFv的新方法,即应用高滴度的噬菌体富集技术和构建表达scFv的原核重组载体系统,为进一步研究抗体生产和载药药物载体工具奠定了综合基础。获得的阳性表达的scFv能在癌症治疗中识别PD-L1抗原有很好的应用前景,并且可以消除其它多克隆抗体在组织和细胞中造成的不良影响。本研究制备的新型药物可以用作位点特异性偶联的有效工具,可以在体外大范围地针对PD-L1阳性癌细胞的特异性进行检测,并且可以用于进一步的体内测试和临床开发。另外,构建表达的全长抗体保留了对PD-L1表面抗原的高亲和力,创新性在于没有其他关于借助CHO细胞表达产生抗PD-L1蛋白的文献研究。该抗体通过阻断PD-L1/PD-1相互作用和抑制肿瘤的作用,为药物开发和癌症免疫治疗提供了一条新的途径。