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点击化学是一种高效和高选择性的化学方法,具有反应原料范围广,反应产物无需纯化等优点。本世纪初,Sharpless等人认为点击反应须符合以下几点：适用范围广、易实现、原料易得、在氧气和水环境中稳定、产物分离必须十分简单、且不借助色谱分离。当前点击反应已经广泛应用于药物研发、临床医学、生物化学、材料科学、蛋白质组学和DNA研究等领域。1,2-氨基硫醇和2-氰基苯并噻唑(CBT)之间的缩合反应是一种在萤火虫体内进行的高效点击反应,具有条件温和、速度快、生物兼容性好等优点。该点击反应的缩合产物以及自组装形成的纳米结构的基本理化性质,如分子量、纳米结构的大小和形貌等均可以由反应单体结构或者反应条件控制(即溶液pH、还原性或者酶的种类等)。基于此,其可被灵活广泛地用于材料化学领域以制备低聚体纳米粒子或交联聚合物等。通过改变反应原料上连接的功能性基团,该反应又可应用于分子显像(包括光学、磁共振和核素成像)、生物分子修饰、药物设计、功能化蛋白组学、病理学等领域。基于这一点击反应,我们合成了不同的功能化原料,在不同的生物学领域和体系内展开应用,其主要分为以下七个部分：(1)基于上述1,2-氨基硫醇与CBT之间的点击反应,在体外或者细胞内pH7.4的环境中,还原型谷胱甘肽(GSH)诱导小分子CBT-Cys(SEt)发生缩合并自组装成纳米环,引起380nm处可见吸收光谱值的增大。本方法可以选择性地检测生物样品中的GSH而避免了半胱氨酸(Cys)的干扰。通过内标法,我们成功的测得HepG2细胞内的GSH含量。为了更好的了解纳米环的形成机制,我们详细考察了GSH浓度和反应时间对纳米环直径和环宽的影响。(2)含有一个CBT和两个双硫键保护Cys的AB2型小分子Cys(SEt)-Lys[Cys(SEt)]-CBT在还原缩合自组装后形成表面含有大量Cys残基的纳米粒子(直径约为21-37nm)。我们通过Cys残基上的氨基耦合表面带羧基的近红外发光量子点,再通过Cys残基上的巯基与马来酰亚胺修饰的叶酸(Mal-FA)反应,最终所得纳米粒子既能发射近红外荧光,又能特异性地识别携带叶酸受体的肿瘤细胞及组织,实现了肿瘤靶向的近红外成像研究。(3)鉴于至今仍没有利用解组装策略来监测酶活性的近红外探针,我们设计了近红外化合物Cys(StBu)-Arg-Val-Arg-Arg-Lys(FPR-675)-CBT来特异性地检测细胞中及体内的Furin蛋白水解酶。其中Lys侧链所接染料FPR-675用于提供近红外荧光信号,而肽链Arg-Arg-Val-Arg (RRVR)为Furin酶的底物。在还原剂作用下,两个分子间的CBT与Cys缩合成环二聚体,然后环二聚体自组装成纳米粒子,FPR-675的近红外荧光被淬灭；而在Furin酶作用下,纳米粒子解组装成游离单体,近红外荧光得以重现。这种off-on过程提供了一种特异性检测Furin酶活性的近红外荧光成像方法。(4)我们开发了一种可以同时检测GSH和Casp3/7的双功能19F NMR/MRI探针Cys(StBu)-Asp-Glu-Val-Asp-Lys(FMBA)-CBT (1),其中Lys侧链上所连接的FMBA(3,5-双三氟甲基苯甲酸)基团用于提供19F NMR/MRI信号。当探针1进入细胞后,胞内GSH还原Cys上的双硫键,从而引发Cys和CBT的缩合,继而探针自组装成纳米粒子。变成纳米粒子后,FMBA分子转动减慢,两个19F自旋核之间的距离减小,19F磁自旋的横向弛豫变快,导致19F NMR信号峰展宽、信号强度减弱。在Casp3/7蛋白水解酶的作用下,组成纳米粒子的二聚体被剪切断开,纳米粒子解组装为游离单体,19F NMR信号强度增强。借助这种on-off-on过程,我们可以相继检测GSH的浓度和Casp3/7的活性。(5)在工作(4)的基础上,我们报道了两种可以特异性检测Lgmn活性的19F NMR/MRI探针Cys(StBu)-Ala-Ala-Asn-Lys(FMBA)-CBT (2)及化合物Ac-Ala-Ala-Asn-Cys(StBu)-Lys(FMBA)-CBT (2-A),其中Ala-Ala-Asn是Lgmn的酶切底物。与工作(4)类似,当探针2进入细胞后,胞内GSH还原Cys上的双硫键,Cys和CBT之间发生缩合使探针分子自组装成纳米粒子,导致’9FNMR信号峰展宽、信号强度减弱。在Lgmn蛋白水解酶的作用下,组成纳米粒子的二聚体被剪切断开,纳米粒子解组装为游离单体,19F NMR信号强度得以增强。通过这种on-off-on的过程,我们可以相继检测GSH的浓度和Lgmn的活性。探针2-A采取的则是另一种策略。当探针2-A进入细胞后,在还原剂和Lgmn的酶切作用下,裸露出的N端Cys与CBT发生缩合使探针分子自组装成纳米粒子,从而降低19F NMR的信号强度,实现了对Lgmn活性进行检测的on-on-off过程。(6)多药耐药性(MDR)是肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的防御机制,也是导致化疗失败的主要原因之一,因此开发更多更好的抗多药耐药性策略非常重要。与常见的通过抑制MDR外排泵作用或利用纳米载体负载大量药物的方法不同,我们设计了一种可胞内自组装的纳米药物,其靶向富集和逐渐缓释药物的策略为抗MDR的发展提供了新思路。我们设计的探针为Ac-Arg-Val-Arg-Arg-Cys(StBu)-Lys(taxol)-CBT (CBT-Taxol)当CBT-Taxol进入Furin酶高表达的癌细胞后,Cys上双硫键被细胞内大量的GSH还原,Ac-Arg-Val-Arg-Arg被Furin剪切脱离,裸露的Cys与CBT缩合形成环二聚体再通过自组装生成含紫杉醇(taxol)的纳米粒子(Taxol-NPs)并富集在细胞中,最后在胞内酯酶作用下缓慢解组装释放出游离的taxol抑制细胞生长。细胞及小鼠活体实验表明,与单纯taxol相比,CBT-Taxol的耐药指数分别提高4.5倍及1.5倍,并且该探针的生理毒性显著低于taxol。因此这种新型的抗MDR策略将为药物设计及癌症治疗提供新思路。(7)细胞间的相互作用对生物体的性能及发育具有重要影响。为了更好地在体外研究细胞间的相互作用,人为地在不同类型的细胞间建立起细胞连接桥梁面临着极大挑战。借助两个生物正交点击反应,我们设计了四个点击反应元件Mal-CBT、Mal-Cys、Mal-Alkyne和Mal-N3,并且成功地将三种颜色的细胞桥联在一起。我们首先通过HPLC和ESI-MS验证了两种点击反应之间的正交性。接着通过马来酰亚胺与细胞表面巯基的结合作用,在三种不同颜色荧光蛋白表达的原核细胞E. Coli(或真核细胞HEK293T)表面分别修饰化合物Mal-Cys、Mal-CBT和Mal-Alkyne或Mal-N3,使这三种颜色的细胞特异地桥联起来。由于HEK293T细胞表面的巯基含量比E. Coli的高,其桥联概率也要大于E. Coli。结果表明：如果用n种正交点击反应,我们可以对n+1种细胞进行桥联,这为研究多种细胞间的相互作用提供了十分有效的方法。本论文以CBT-Cys点击缩合反应为平台,拓展了这一体系在分子成像、肿瘤治疗以及细胞组装中的应用。该反应的高效性和良好的生物兼容性为生物分子的检测、显像及修饰提供了新的方向。