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实验目的: 肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）是一组以肺血管重建，血管腔狭窄、阻塞从而引起持续性肺动脉压力升高的慢性疾病。根据2009年欧洲呼吸学会和欧洲心脏病学会联合颁布的肺动脉高压诊治指南，最新诊断分类显示多种因素可以导致PAH，其中最重要的疾病之一就是结缔组织病(connective tissuedisease，CTD)，如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease，MCTD)、系统性硬化症(systemicsclerosis，SSc)及类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等。与特发性肺动脉高压(idiopathic PAH，IPAH)相比，CTD合并PAH的患者往往治疗效果不佳，尤其SSc合并PAH的患者预后极差，2年生存率仅约为40％，成为临床上CTD患者重要的死亡原因之一。 CTD患者伴发PAH的发病机制目前仍不清楚。有研究显示血管内皮细胞(endothelial cell，EC)的异常改变往往是PAH疾病的最早期特点，如MCTD的患者在确切的PAH临床表现出现之前，肺部就已出现微小的血管病理改变，如微动静脉血栓形成及管壁增厚等，血管的损伤可能最终导致PAH的发生。 近年来，人们发现在风湿病患者的外周血中可检测到一组能与血管内皮细胞(endothelial cell，EC)表面抗原相结合的抗体，即抗内皮细胞抗体(anti-endothelialcell antibodies，AECA)，其可能通过多种机制与内皮细胞相互作用，参与CTD发病过程，并发现AECA可能在CTD伴发PAH中发挥一定的作用。AECA的致病机制目前认为可能与AECA诱导EC活化及其释放的细胞因子有关，这也可能是CTD伴发PAH的重要病理生理学机制之一。 关于AECA靶抗原特征目前仍不清楚。已报道的关于AECA的研究多采用脐静脉内皮细胞，报道的AECA识别靶抗原的分子量约在15-200KD之间，不同CTD患者AECA可以识别的膜抗原成分亦不同。考虑到不同的细胞表面的抗原表型可能存在一定的差异性，本文主要应用人肺动脉血管内皮细胞(human pulmonaryartery endothelial cell，HPAEC)作为底物，分别采用不同方法检测不同CTD伴或不伴PAH患者及部分健康对照人群血清中相应的抗HPAEC抗体，比较并分析该抗体与临床的相关性，分析该抗HPAEC抗体的体外相关作用，以期阐明抗HPAEC抗体在CTD伴PAH发生中的可能机制。 实验方法: 一、应用间接免疫荧光法及细胞ELISA法检测CTD伴或不伴PAH患者血清中抗HPAEC抗体，分析该抗体的临床相关性 HPAEC购自Sciencell公司，应用血管内皮细胞专用培养基(ECM)培养。以培养的HPAEC为底物，分别采用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence，IIF)以及细胞ELISA方法检测不同CTD患者血清中的抗HPAEC抗体。所有41例CTD患者均为2009年2月至2011年2月中国医科大学附属盛京医院门诊及住院的病人。实验组为CTD合并PAH组的患者，共19例，包括SLE8例，MCTD6例，SSc3例，pSS1例及uCTD1例。实验对照组为CTD不伴PAH的患者，共22例，疾病组成与实验组相匹配。另外选取20例健康对照组作为正常对照组。分析上述各组测得的抗HPAEC抗体与临床相关特征及实验室资料的关系。 二、蛋白质免疫印迹法检测血清特异性抗HPAEC抗体 将培养的HPAEC用胰蛋白酶/EDTA溶液自细胞培养瓶消化分离，PBS洗涤后经细胞裂解液裂解提取HPAEC细胞抗原。细胞抗原蛋白裂解液煮沸后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至PVDF膜后准备与血清标本孵育。PVDF膜先用含5％脱脂奶粉的PBS封闭，然后用TTBS洗涤3次并切成小条，分别与不同分组的血清标本(1∶100稀释)于聚乙烯透明袋4℃孵育过夜。第二天充分洗膜后与稀释的(1∶2000)碱磷酶标记的羊抗人IgG二抗室温摇匀2小时。后再次用TTBS洗涤3次，之后加入底物摇床混匀显色，蒸馏水清洗终止反应，扫描封存。 三、分离纯化血清IgG抗HPAEC抗体 特异性抗HPAEC抗体阳性血清IgG应用Protein G纯化分析试剂盒分离纯化。血清用结合缓冲液1∶1稀释，10000rpm离心20min。取上清上样至Protein G亲和分离柱中。样品与Protein G琼脂糖凝胶充分作用后，用15ml结合缓冲液冲洗。结合的IgG用5ml洗脱缓冲液洗脱，沈脱液用500μl结合缓冲液中和。通过Bradford法测定IgG浓度。 四、抗HPAEC抗体作用后细胞培养上清中ICAM-1及RANTES的浓度测定 分离纯化的特异性抗HPAEC抗体IgG加至HPAEC的培养液中，调整IgG的终浓度至1mg/dl。孵育48h后，收集培养上清。用ELISA试剂盒检测上清中ICAM-1及RANTES含量。通过酶标仪于450nm波长读取OD值，绘制标准曲线，计算ICAM-1及RANTES的含量。 五、流式细胞术测定抗HPAEC抗体诱导HPAEC凋亡 分离纯化的特异性抗HPAEC抗体IgG加至HPAEC的培养液中，调整IgG的终浓度至1 mg/dl。分别孵育不同时间（12，24，48小时）后，用胰蛋白酶/EDTA溶液消化法收集细胞，应用AnnexinⅤ-FITC和PI双染法经流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 实验结果: 1、以HPAEC为底物，IIF法检测抗HPAEC抗体在41例CTD患者中的阳性者为17例(41.5％)。无论伴或不伴PAH，CTD患者的阳性率均明显高于健康对照组（p＜0.05）。CTD伴PAH患者阳性率明显高于(57.9％) CTD不伴有PAH患者(27.3％)，差异有显著性。抗HPAEC抗体在伴有雷诺现象的CTD患者检出率为62.5％，明显高于无雷诺现象患者的检出率(11.8％)，差异有统计学意义(p=0.001)。 2、细胞ELISA法检测抗HPAEC抗体在41例CTD患者的阳性率为51.2％。CTD伴或不伴PAH的患者其抗HPAEC抗体血清水平及阳性率两方面均明显高于健康对照组，差异有统计学意义(p＜0.01)。CTD伴或不伴PAH患者细胞ELISA法检测的抗HPAEC抗体的阳性率差异未见显著性(p＞0.05);但CTD伴PAH患者抗体水平明显高于不伴PAH者（0.797±0.312 versus0.480±0.175），差异有统计学意义(p＜0.001)。抗HPAEC抗体血清水平与CRP明显相关（相关系数R=0.417，p＜0.05）。 3、以HPAEC细胞提取物为抗原，应用免疫印迹法检测抗HPAEC结果显示，41例CTD患者中共有28例患者血清中有针对不同条带的抗HPAEC抗体。CTD伴PAH患者抗HPAEC抗体识别的条带主要包括28KD，35 KD，53KD，75 KD和98KD。CTD不伴PAH患者识别的抗原条带主要包括35KD，53 KD，70KD和75KD等，健康对照组无特征性条带发现。其中识别98KD-抗HPAEC抗体仅在CTD合并PAH患者组中出现(21.1％，4/19)。识别75KD的抗HPAEC抗体在CTD患者血清中检出频率最高（共14例阳性）。识别75KD和98KD的抗HPAEC抗体在CTD伴PAH患者阳性率明显高于CTD不伴PAH患者(p＜0.05)。 4、抗75KD和98KD HPAEC抗体阳性血清纯化IgG抗体以终浓度1mg/dl加入HPAEC的培养上清中共同孵育，48小时后上清中RANTES的浓度为35.6±1.79pg/ml，而抗HPAEC抗体阴性者RANTES的平均浓度为13.8±0.28pg/ml，统计学分析检测差异显著(p＜0.05)。相同方法检测48小时后上清中ICAM-1的浓度为795.2±32.5pg/ml，而抗HPAEC抗体阴性者ICAM-1的平均浓度为192.8±33.4pg/ml，统计学分析检测差异显著(p＜0.001)。 5、抗75KD和98KD HPAEC抗体阳性血清纯化IgG抗体以终浓度1mg/dl加入HPAEC的培养上清中共同孵育，结果显示抗HPAEC抗体IgG作用不同时间后凋亡的细胞百分数为13.16±2.04％（12小时），23.62±3.22％（24小时），31.06±4.17％（48小时），而加入相同剂量的正常人IgG，不同时间后凋亡细胞数变化不明显，差异有显著性(p＜0.05)。 结论: 1、IIF法及细胞ELISA法均证实CTD患者，尤其是CTD伴PAH患者血清中存在与HPAEC反应的抗HPAEC抗体。两种方法均可用于检测抗HPAEC抗体，在一定程度上可以互为补充。 2、抗HPAEC抗体与CTD的疾病活动指标CRP相关，可作为观察疾病活动性的血清学指标之一并可用于监测治疗。 3、免疫印迹法证实抗HPAEC抗体是一组异质性抗体，可识别不同分子量的抗原成分。识别75KD和98KD的抗HPAEC抗体可能为CTD伴PAH患者的特异性抗体。 4、抗HPAEC抗体可通过与细胞表面的抗原结合，在体外直接诱导HPAEC分泌释放粘附分子ICAM-1以及趋化因子RANTES。 5、抗HPAEC可体外诱导HPAEC凋亡。 6、抗HPAEC抗体介导的多种机制共同作用引起HPAEC损伤可能是CTD伴发PAH的病理生理学基础。