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目的:线粒体12SrRNA基因是母系遗传性耳聋的突变热点区域之一,本研究建立一种基于PCR-HRM技术的药物性耳聋相关线粒体12SrRNA基因1494 C>T和1555A>G突变快速检测方法。方法:我们主要针对目标位点设计特异性的引物,通过饱和荧光染料进行解链分析。首先采用定点诱变克隆策略构建突变质粒DNA标准品,再建立突变位点靶序列PCR-HRM分析体系,并对体系进行一系列优化,最后通过对106例非综合征耳聋患者标本进行盲法分析评价,同时以DNA直接测序法进行验证。结果:建立的PCR-HRM检测方法能准确检出线粒体12SrRNA基因1494 C>T和1555A>G突变,体系的稳定性好、灵敏度高,各基因型的熔解曲线特征明显且易于分析判断;106例非综合征耳聋患者标本中检出6例1555 A>G突变,检测结果与DNA测序结果一致。结论:建立了药物性耳聋相关人类线粒体12SrRNA基因1494 C>T和1555 A>G突变的PCR-HRM检测方法,该方法操作简单快速、结果准确可靠,可应用于人群筛查和临床常规分子诊断。某些遗传病的致病基因与全基因组范围内的一些基因序列普遍存在高度同源性,这可造成基因点突变检测结果的假阴性。最经典的例子是由于α珠蛋白基因突变导致的α-地中海贫血,地中海贫血是全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病之一,我国南方是α-地贫高发地区。α珠蛋白基因点突变主要发生在α2基因上,但α2珠蛋白基因与α1珠蛋白基因同源性高达97%,这容易造成α2珠蛋白基因点突变检测结果的假阴性,也是非缺失型α-地贫基因的检测方法更新缓慢的主要原因。目前已在临床上应用的α2珠蛋白基因点突变检测技术存在操作繁琐、检测通量低、成本高等诸多问题,不适用于大规模人群筛查及常规分子诊断。本研究主要基于巢式非对称PCR结合荧光探针与解链分析策略,建立一种快速准确检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五种点突变的新方法,且有效解决高同源性造成假阴性的问题。首先设计特异性扩增α2-珠蛋白基因及目的序列单链引物,对α2-珠蛋白基因高度富集,排除同源性α1-珠蛋白基因的影响,再针对目标位点设计特异性探针,结合熔解曲线分析检测点突变。然后通过对体系的引物结构与组成、扩增组分、反应程序等一系列条件调整与优化,建立一种高效解决高同源性问题及准确检测α2珠蛋白基因五种点突变的新方法,并收集1250例已确诊的非缺失型α-地贫和正常基因型gDNA标本对体系进行稳定性、特异性、灵敏性、实用性等全面评价及通过盲法分析对体系进行临床应用评价。最后以实验室自建检测体系的形式制备成常规使用的检测试剂盒,经充分的临床应用后进行产业化推广和应用。本研究的结果显示,所设计的引物及探针能够有效检出相对应的基因型,通过对检测体系的一系列条件优化及评价,建立的新方法基于荧光PCR平台快速准确检测非缺失型α-地贫。采用新方法检测收集的1250例样本,阳性率为11.52%,准确率高达100%,检测灵敏极高,对检测模板要求低。与传统的检测方法相比,该新方法具有操作简单,省时、判断结果直观、实用性强、高效解决假阴性问题等优势。因此,本研究建立了基于巢式非对称PCR结合荧光探针杂交与解链分析策略快速准确检测五种非缺失型α-地贫新方法,能够有效解决高同源性问题,且通量高、成本低、满足大规模人群筛查及常规分子诊断的方法学需要,且可为其他基因点突变疾病提供新的检测方法思路。