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围食膜(peritrophic membrane,PM)是昆虫体内非常重要的中肠防御系统。近年来对于围食膜在生物化学及其分子生物学水平上的了解日趋增多,但是家蚕围食膜蛋白的研究还不是很丰富,尤其是家蚕围食膜与家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)病抗性相关蛋白的研究仍旧匮乏。因此,本研究以家蚕围食膜作为研究对象,利用蛋白质组学技术对BmNPV抗性、感性及其近等基因系的围食膜的蛋白质表达谱以及差异表达谱进行分析,为进一步探索家蚕对BmNPV病毒的抗病机理奠定基础。本研究的主要内容和结果如下:
(1)对抗性、感性及其近等基因系三个品系家蚕,在相同的条件下饲养,对5龄起幼虫经口接种BmNPV病毒,24h后,解剖幼虫取出围食膜并观察外观形态,并将正常饲养未接种病毒的作为对照。结果发现,感染病毒后,三个品系家蚕幼虫的围食膜均表现为长度变短、韧性降低、质地混浊,但是感性品系306幼虫的围食膜特别明显地变薄变脆,暗示着家蚕围食膜极有可能与抗BmNPV病毒有关。
(2)比较平衡酚-醋酸铵甲醇沉淀法和三氯乙酸(TCA)-丙酮法对于家蚕围食膜蛋白的提取效率及提纯度,结果发现,TCA-丙酮法对于家蚕围食膜蛋白的提取效果较好,蛋白质纯度较高,并且操作简单,能够满足二维电泳分离的要求,因此,选择该法作为家蚕围食膜蛋白的提取方法。
(3)利用二维凝胶电泳技术和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定技术对家蚕围食膜的蛋白质表达谱进行分析。总共分离到27个围食膜蛋白,并鉴定了其中的23个。生物信息学分析发现家蚕围食膜蛋白涉及结合、催化、代谢过程等生理活动。
(4)利用蛋白质组学技术对BmNPV抗性与感性品系家蚕的围食膜蛋白进行研究,找出家蚕围食膜上与BmNPV抗性相关的蛋白质。二维电泳后总共分离鉴定到27个仅出现在抗性品系NB和BCs中的差异蛋白点,其中3个蛋白点出现在经口接种BmNPV病毒的NB品系家蚕围食膜中,12个蛋白点出现在未接种病毒的NB对照组;4个蛋白点出现在经口接种BmNPV病毒的BCs品系家蚕围食膜中,8个蛋白点出现在未接种病毒的BCs对照组,推测这些蛋白有可能与抗BmNPV病毒有关。生物信息学分析发现这些抗性相关的差异蛋白在结合、催化、细胞进程和高分子代谢过程等方面的功能较为显著。此外,在27个蛋白点中,NB对照组与BCs对照组共有的蛋白点有5个,分别是Trypsin-likeprotease(胰蛋白酶类蛋白酶)、Metallothionein family member mtl-1(金属硫蛋白家族成员mtl-1)、GH14538(Drosophila grimshawi)、Synaptobrevin(突触泡蛋白)和Thymidine kinase(胸苷激酶)。