矮牵牛单重瓣相关基因的序列比较分析及功能验证

• 作 者: 肖育
• 机 构: 华中农业大学
• 出 处: 华中农业大学
• 发表日期: 2015年期
• 关键词: 矮牵牛 重瓣花 启动子 RNAi 遗传转化

有关花发育的研究一直是植物领域中的研究热点,从二十多年前ABC模型的提出,到现在的ABCDE模型,该理论研究仍在不断的拓展和深入。重瓣花作为一类高观赏价值与高经济价值的植物材料,一直是品种培育的目标之一。对于其形成机理,人们进行了大量的研究,其中多是基于花发育的模型,利用正向遗传学与反向遗传学的方法对植物材料进行研究,研究成果多集中在B类基因与C类基因上。对于矮牵牛而言,作为研究花发育的模式植物之一,其重瓣花的性状表现为雄蕊瓣化和雄蕊数目的增多。已有研究证明C类基因PMADS3和FBP6的功能同时缺失可以将雄蕊转变为花瓣,同时失去花分生组织的决定性,但是花器官的数目并没有增多。于是我们推测,在矮牵牛重瓣花的形成过程中,还有其他基因的共同参与。遂本实验室以保存的单重瓣矮牵牛近等基因系为材料,在先期进行了抑制消减杂交分析,基因芯片分析,实时定量PCR分析等一系列实验,获得了一些与单重瓣形成有关的基因:PMADS3(gi|313112),FBP6(gi|374086023),PMADS12(gi|34452082),FBP20(gi|13384053),sc PD4(gi|227581095),ssh PD1(gi|20492)。本实验的目的即对这些基因进行分析和功能验证。主要的实验结果如下,1.分别以单瓣矮牵牛与重瓣矮牵牛的基因组DNA为模版。克隆了以下序列:PMADS3的启动子与基因全长,FBP6的启动子与第二内含子,PMADS12的启动子,FBP20的启动子,sc PD4的启动子,ssh PD1的启动子。比较这些序列在单瓣矮牵牛与重瓣矮牵牛之间存在的差异,结果表明上述序列在单瓣矮牵牛与重瓣矮牵牛之间不存在显著差异,特别是关键元件的位点上不存在差异。2.根据上述基因在单重瓣矮牵牛中的表达量差异,运用Gateway技术构建了PMADS12,FBP20,sc PD4,ssh PD1的干涉载体,并转化矮牵牛W115,获得转基因植株PMADS12干涉载体23棵,FBP20干涉载体18棵,sc PD4干涉载体20棵,ssh PD1干涉载体28棵。将前人构建好的PMADS12超表载体转化矮牵牛W115,获得转基因植株12棵。对转基因植株的园艺学性状进行观测,在一颗PAMDS12的超表植株上观察到:雄蕊直接生长于花瓣上,花丝与花瓣融合。其他转基因植株没有发现与花发育相关的性状,营养器官及植株的长势也没有发现与野生植株存在显著差异。根据上述结果,我们分析这些基因在单重瓣矮牵牛中的表达出现差异不是由它们的启动子造成的。特别是已被证明与单重瓣形成直接相关的PMADS3与FBP6,它们的相关序列在单重瓣矮牵牛之间也不存在差异,那么必存在其他因素影响了它们的表达。而转基因植株的表型还有待进一步分析。