论文部分内容阅读
杰多霉素是Streptomyces venezuelae ISP5230在热激、乙醇刺激或噬菌体感染等特殊的环境压力条件下产生的非典型角葸环类抗生素。为提高杰多霉素的产量，简化发酵工艺，用组成型强启动子ermEp*替换杰多霉素合成基因簇中包括四个调控基因和第一个结构基因上游启动子在内的3.4 kb的DNA片段，所得重组菌株的发酵分析表明，杰多霉素的合成不再受环境压力的调控，且产量比野生型提高将近一倍，说明启动子替换是一个简化调控，提高产量的合理途径。
杰多霉素的配糖体(jadomycin A)中包括相邻的二氢吡啶和唑酮环，这种不同寻常的杂环排列方式是杰多霉素特有的。虽然生物合成途径还不清楚，前期工作证明杂环氮原子来源于培养基中的主要组分-L-异亮氨酸。通过用其它的蛋白质氨基酸完全代替培养基中的L-异亮氨酸，产生了11种新的杰多霉素衍生物。经过对六个化合物(jadomycin B、V、F、S、T和Ala)的分离纯化和NMR数据的精细分析，表明杰多霉素B、V、F和Ala是3a-S和3a-R两种构型的的混合物，两种构型处于动态平衡之中无法分开。杰多霉素B和五种新衍生物的细胞毒活性分析显示：杰多霉素S对HepG2，IM-9和IM-9/Bcl-2细胞的活性最高，杰多霉素F对H460的活性最高，并且它们的细胞毒活性与其引起细胞凋亡的能力是相对应的。唑酮环上来源于不同氨基酸的侧链基团对生物活性有明显的影响。因此，杰多霉素是一个理想的可供修饰的分子骨架，通过引入不同的唑酮环侧链可以得到许多新的具有生物活性的角蒽环化合物。
基因失活和异源表达实验证明JadF、JadG和JadH共同参与杰多霉素的氧化开环过程，其中任何一个基因的缺失都导致该过程的中断，暗示其可能以蛋白复合物的形式行使功能。为纯化这个蛋白复合物，人工合成一个包括链亲和素结合肽和蛋白C表位的串联亲和标签。C端融合SC亲和标签的JadG与JadF和JadH在Streptomyces coelicolor YU105中共表达，可以转化2，3-dehydro-UWM6生成杰多霉素A。但链亲和素只能纯化到JadG，可能是因为三个蛋白间的相互作用较弱，复合物在纯化的过程中解离。
实验室前期，在Escherzchia coli中表达的带有His标签的JadF、JadG和JadH三个蛋白中，仅有JadH表现出对2，3-dehydro-UWM6的催化活性，JadF和JadG没有表现出明显的催化活性。由于担心三个蛋白带有的His标签可能影响蛋白的功能或复合物的形成，利用NEB的IMPACT系统在E.coli ER2566中分别表达不含额外标签序列的JadF、JadG和JadH。纯化的三个蛋白组合后仍不能完成从2，3-dehydro-UWM6到杰多霉素A的体外转化。由于共表达JadF、JadG和JadH的S.coelicolor YU105或Ecoli细胞均可以完成从2，3-dehydro-UWM6到杰多霉素A的转化，体外转化失败的原因可能是JadF和JadG在纯化过程中失活，也可能是蛋白正常行使功能需要细胞的微环境。