论文部分内容阅读
Resilin-R5融合蛋白是将天然超强弹性蛋白Resilin和硅沉积肽R5线性连接形成的人工嵌段高分子。其中，Resilin是一类具备超强弹性的生物蛋白，在一些昆虫外骨骼，飞行系统，发声系统等有着广泛的分布，交联后的Resilin所具备的超高弹性以及变性复原能力要远远高于普通橡胶，在材料学、医学和组织工程等领域具备很高的潜在应用价值。R5肽来自硅藻（Cylindrotheca fusiformis细胞壁中silaffin前体多肽C端的由19个氨基酸构成的功能单位，能够诱导和调节硅藻中二氧化硅的沉积作用。其所展示的体外二氧化硅沉积性能，能获得具有不同形态学特征的拱形结构和细长纤维结构，暗示了其在纳米材料等领域的潜在应用价值。
本论文为了获得兼具“高弹性”和“硅沉积”性能的新型功能生物材料，将具有高弹性的Resilin蛋白与具有硅沉积作用的R5肽进行了融合，研究了其在大肠杆菌中的表达，及纯化方法。首先，将果蝇弹性蛋白基因CG15920序列与硅藻R5肽基因序列进行拼接，经过稀有密码子优化后合成重组基因resilin-r5。然后将其插入原核表达载体pET28a，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS获得表达菌株，并通过IPTG进行诱导表达。同时将resilin-r5插入到载体pUC57后转化E.coli△clpX，E.coliBW25113，E.coli DH5α等大肠杆菌菌株比较不同菌株的表达差异，以期获取更高的目标蛋白表达量。最后以盐析加热法和Ni离子柱亲和层析法纯化带组氨酸标签的重组融合蛋白。最终实现Resilin-R5融合蛋白的高效表达，产量达到120mg/L发酵液。并采用6×His标签Western blot和蛋白质C端测序，证实所获得融合蛋白为全长目标蛋白Resilin-R5。
进一步将Resilin-R5与天然阳性多糖-壳聚糖按一定比例共混，制备了系列Resilin-R5/壳聚糖共混复合膜材料。对复合膜材料的溶胀性能、透气性、吸水率、保水率、光催化交联性能、二氧化硅沉积性能和力学性能进行了测试;并采用傅立叶变换红外光谱分析、差示扫描量热分析和显微观察对复合膜内部基团间相互作用、共混性能和膜形貌进行了测试分析。结果表明，伴随Resilin-R5比例升高，复合膜溶胀比呈逐步下降趋势，最低溶胀比约为纯壳聚糖膜的50％;当Resilin-R5比例分别为7％和33％时复合膜透气性较高，分别达到403g/m2·24h和392 g/m2·24h，均显著高于纯壳聚糖膜;复合膜的吸水率和保水率伴随Resilin-R5比例升高呈升高趋势，最高分别达到264％和231％，均显著高于纯壳聚糖膜;复合膜形貌表现为多微球聚集膜材料，经光催化后能够形成紫外下发射蓝色荧光的交联体，并能催化硅酸甲酯水解在膜表面或内部形成颗粒状沉积物;当Resilin-R5比例为13％时，复合膜具有最高拉伸长度和最高拉断强度，分别为41.6％和32.1MPa，显著高于纯壳聚糖;傅立叶变换红外光谱和差示扫描量热分析结果表明，Resilin-R5与壳聚糖间存在相互作用，且当Resilin-R5比例低于20％时，Resilin-R5与壳聚糖间具有良好的共混性能。
综上所述，本文设计合成了resilin-r5融合基因，并在大肠杆菌中实现了高效表达和纯化，创制了Resilin-R5这一新型蛋白质类生物材料;Resilin-R5/壳聚糖复合膜具有优良的材料学性能，在医用敷料和缝合线方面具有良好的应用潜力。