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结核病主要是由分枝杆菌引起的一种传染病。自上世纪90年代以来,结核病呈世界范围性的回升,每年死亡人数达300万,属各类传染病死亡人数之首,创近年来历史最高记录。我国现有结核病人500万,是世界上22个结核病高负担的国家之一,加之人口的流动,结核多重耐药菌株(MDR)的出现,与艾滋病的合并感染,以及多种社会经济因素造成了诊断和治疗上的巨大困难,严重影响到结核病的控制。因此,结核病仍是人们关注的重要健康问题。WHO指出:“在存在结核的国家中,人类始终受到它的威胁,除非着手消灭结核病,否则,人类结核病的控制是不会成功的”。目前,一些较发达的国家和地区,如美国、澳大利亚、北欧等已基本消灭了牛结核病,但由于人结核病和野生动物结核病的存在,致使这些国家仍对结核处于不断的检疫和高度的警惕之中。在广大的发展中国家,该病仍严重的流行。近年来,随着分子生物学和免疫学的发展和应用,对分枝杆菌的基因序列及其主要功能以及发病机理和免疫机制等都有了新的认识和了解,这些均将有利于结核病的防治。据报道,结核分枝杆菌(MTB)的热休克蛋白(HSP)16.3在结核分枝杆菌感染过程中的生存有重要作用。MTB HSP 16.3起初被认为是免疫相关的14Kda-16 Kda抗原,作为人结核感染时的重要成分发挥着稳定蛋白和生存的重要作用。85%的活动期结核患者对此抗原反应为阳性,说明这个抗原在结核杆菌感染的体内发挥重要作用。于是这个14Kda抗原被重新命名为MTB HSP 16.3。在结核潜伏期,MTB HSP 16.3高度表达,积累成为潜伏期细菌表达的主要蛋白质。在对数生长期,MTB HSP 16.3的大量表达会减缓细菌的生长速度,并且可抗拒潜伏期的体外自溶。MTB HSP 16.3与其他小分子热休克蛋白家族的蛋白具有高度同源性,发挥着膜辅助蛋白的作用。小分子热休克蛋白家族具有的共同特征是靠近C端有一段长约80-100个氨基酸的“α-crystallin”结构域,这个结构域对伴侣功能非常重要。MTB HSP 16.3具有单链、活动的结构可以形成三聚体,在体外发挥着分子伴侣的作用。本实验在国内外结核研究的基础上,采用现代分子生物学技术以测定卡介苗(BCG)的HSP16.3基因序列及其在大肠杆菌中的表达为主要研究内容,目的在于研究分枝杆菌的HSP16.3的特性,为研究结核杆菌的潜伏期奠定基础。在本研究中,以BCG的染色体DNA为模板,PCR扩增HSP16.3成熟蛋白基因,选用pProEXHTb vector system成功克隆了BCG的HSP16.3成熟蛋白基因。通过酶切鉴定和测序鉴定,证实了所克隆的基因与目的基因大小一致,成功构建了pProEX HTb- HSP16.3质粒,序列同源性为100%,氨基酸序列也完全一致,表明该基因在BCG中是高度保守的。该表达质粒在与之相匹配的E. coli BL21中经IPTG诱导4h后,表达量达到了高峰。经SDS-PAGE和免疫印迹分析证实该蛋白的表达。因此,本研究为进一步研究分枝杆菌潜伏期机制奠定了一定的基础。