AFLP技术在枣种质资源鉴别和分类研究中的应用

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 28次 | 上传用户:wb_0622
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AFLP(扩增片段长度多态性)是一种新的DNA分子标记技术,具有高效、稳定、可靠的特点。广泛应用于品种鉴定、遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建等方面。枣是起源于我国的重要果树,品种繁多,分布范围广,遗传背景复杂。枣的分类涉及形态学、孢粉学、生物化学、分子生物学等领域,经历了从形态多样性到DNA多样性的发展过程。由于分类标准不统一、分类手段的局限性,导致分类结果不一致。部分品种来源不清,品种亲缘关系不明,同物异名及同名异物现象十分普遍,不利于枣种质资源的研究和品种的选育与推广。本研究应用银染AFLP技术体系构建了82个枣供试材料的DNA指纹图谱,对枣的种质鉴定、品种分类、亲缘关系、遗传多样性进行了分析,主要研究结果如下: 1.确定了适于AFLP分析的枣基因组DNA提取方法为改良CTAB法,其提取液成份为:100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl,2% CTAB,2%PVP40,50 mmol/L β-巯基乙醇,粗提后的DNA经RNase除去RNA;苯酚/氯仿抽提一次,氯仿/异戊醇抽提一次,去除蛋白质,得到了基本无降解,蛋白质和RNA去除彻底,纯度高、质量好的枣基因组DNA。 2.建立了适合枣基因组的AFLP银染技术体系:在20μL酶切体系中,包括基因组DNA 450ng,NEB buffer22μL,BSA(10mg/mL)0.2μL,EcoR Ⅰ(大连宝生物公司)3U,Mse Ⅰ(NEB公司)3U,加ddH2O至20μL;37℃酶切3h;加上接头,37℃连接10h(或过夜);连接产物稀释10倍进行预扩增;预扩增产物稀释10倍进行选择性扩增;加入10μL Loading Buffer,95℃变性10min,立即冰浴;在6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行电泳分析;银染法检测PCR产物。 3.采用7对引物组合对82个供试材料进行扩增分析,共扩增出467条电泳谱带,平均每对引物产生约67条谱带,其中94条带为所有材料共有,占20.13%,373条为多态性带,多态性检出率为79.87%,从DNA分子水平显示出枣具有丰富的遗传多样性。 4.用7对引物组合构建了82份供试材料的AFLP指纹,采用二歧分类法可以将供试材料一一区分开,并且部分材料拥有自己的特征带,可以作为该材料鉴定的依据。 5.应用离差平方和法对供试材料的AFLP数据结果进行聚类分析,将82个供试材料分为6类,可作为枣分类的依据和基础。 6.建立了82份供试材料的AFLP树状图,结合各样品间的遗传距离(欧式距离)对其遗传多样性进行了分析,揭示了供试材料间遗传背景的相似性及复杂性。 以上研究为枣基因库的建立、品种资源保护利用、优良品种选育、新品种知识产权保护以及亲缘关系的系列研究奠定了基础,同时为枣分子标记辅助育种提供了可能。
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