论文部分内容阅读
白细胞介素1(interleukin 1,IL-1)是一个具有多种免疫调节功能、可以诱发炎性反应以及机体防御反应的炎性细胞因子。它可以活化T细胞(间接活化B细胞)、提高黏附分子表达、诱导一系列其它促炎性细胞因子以及炎性相关蛋白表达,形成炎性反应的放大级联反应。大量证据证明:在免疫和心理应激后产生的促炎症细胞因子白细胞介素-1(IL-1)在神经内分泌学和行为应激反应方面发挥着重要作用。特别是中枢系统产生的IL-1,它是应激诱导的HPA轴的激活和糖皮质激素分泌之间的重要联结,而糖皮质激素在调节记忆功能和神经可塑性上发挥着重要的影响,低浓度时发挥着有益的结果,高浓度时产生有害影响。此外,IL-1信号通路和糖皮质激素分泌产物可以调节急性和慢性应激引起的抑郁症状,通过抑制海马神经元发生改善抑郁症状。然而,在一些生理条件下,比如低水平的IL-1,可以促进适应性应激反应,这些反应是有益的,但是在一些严重或慢性应激条件下,沉默或阻止IL-1可以作为一种预防性和治疗性的手段去缓解一些神经病理学和精神病理学疾病的问题。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源或内源性的短双链RNA(dsRNA)进入细胞后引起的同源mRNA的将解,从而特异性阻断目的基因的表达。推测可能分为以下阶段:首先双链RNA在细胞内被RNA酶III(Ribonuclase III,RNase III)酶切成约21~23nt的小片段干扰RNA(short interfering RNA,siRNA),siRNA与一些蛋白组装形成siRNA-蛋白复合物,即RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)。在ATP存在的情况下,双链的siRNA解旋,解旋后的siRNA反义链引导RISC到达靶mRNA,并与之结合将其降解。本研究通过构建腺病毒介导的siRNA干扰载体,用于沉默IL-1β基因的表达,为下一步基因功能和治疗手段的研究奠定基础。目的:本研究通过构建腺病毒介导IL-1βshRNA表达载体,来抑制IL-1β的表达,以此探讨IL-1β基因的功能与一些神经病理学之间的关系。为腺病毒作为基因治疗的载体提供理论和实验依据。方法:1.利用在线软件设计特异性的IL-1β-siRNA寡核苷酸片段,在体外构建和克隆重组穿梭质粒pAdTrack-IL-1β-shRNA.2. PmeI酶切线性化转化到感受态BJ5183pAdEasy-1中,进行同源重组。3.筛选阳性重组腺病毒载体Ad-IL-1β-shRNA,PacI酶切后转染入HEK293细胞中包装病毒颗粒,得到腺病毒。并在体外巨噬细胞中检测沉默效率。4.将腺病毒注射入大鼠体内,观察对大鼠体重和糖水偏嗜度的影响,并检测大鼠组织中mRNA的表达水平。结果:1.经酶切和序列测序证明成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack-IL-1β-shRNA 2.成功构建了腺病毒载体Ad-IL-1β-shRNA并在HEK293细胞中完成了包装。3.在体外,腺病毒1和腺病毒2感染巨噬细胞后,使其IL-1βmRNA表达水平明显降低,分别下降了63%和72.2%。4.在体内,腺病毒注射后,大鼠体重略有下降,海马组织中IL-1βmRNA的表达也稍微下降,但是与对照组之间无明显的变化。